Биоэлектрогенез у высших растений - Опритов В.А.
ISBN 5-02-004108-4
Скачать (прямая ссылка):
Для установления электрогенных свойств Н+-АТФазы плазмалеммы растений наибольшее значение имеют эксперименты, выполненные на везикулах или липосомах, в которые встроен этот фермент. Если в целой клетке электрогенность Н+-АТФазы может маскироваться рядом процессов, протекающих на поверхностной мембране (работа других электрогенных систем, осуществление компенсаторного транспорта ионов, вторичный активный транспорт и др.), а ингибиторы или активаторы данного фермента могут не проявлять в полной мере своего действия, то в модельных экспериментах имеются значительно более простые и регулируемые условия.
Одним из первых исследований, в которых была продемонстрирована АТФ-зависимая генерация мембранного потенциала на везикулах плазмалеммы клеток высших растений, была работа, выполненная в нашей лаборатории [105, 106]. С использованием флуоресцентных зондов в ней четко показана АТФ-зависимая генерация мембранного потенциала со знаком "плюс" внутри везикул плазмалеммы клеток флоэмы борщевика. Важно, что этот результат был получен с помощью "двойного контроля”, а именно при применении как положительно (аурамин 00), так и отрицательно (АНС) заряженного флуоресцентного зонда. Генерация потенциала в везикулах резко подавлялась в присутствии ингибитора Н+-АТФазы ДЦКД и протонофора КЦХФГ, что указывало на ее связь с работой этой ферметной системы. Знак "плюс" внутри везикул свидетельствовал об их вывернутости, и этот тест на ориентацию везикул является в настоящее время весьма распространенным.
АТФ-зависимая генерация Ет в везикулах плазмалеммы клеток различных органов растений показана и в работах других авторов [51, 198, 399, 653]. Следует, однако, отметить, что проводя эксперименты с
З.Зак. 1401
зз
везикулами, исследователи нередко ограничиваются измерением транспорта протона, не акцентируя внимание на изменении потенциала. Это не дает возможности судить об электрогенности Н+-АТФа-зы.
Для оценки величины Ет, генерируемого Н+-АТФазой в везикулах плазмалеммы высших растений, применяют обычно калибровку флуоресцентных ответов соответствующих зондов по индуцированному валиномицином К+-диффузионному потенциалу. При работе с везикулами плазмалеммы флоэмы борщевика были получены значения в интервале от 10 до 60 мВ [105]. Сходные величины (30 40 мВ) уста-
новлены для везикул плазматических мембран каллюса табака [653]. Сравнительно небольшие мембранные потенциалы, генерируемые в везикулах, могут быть обусловлены недостаточной замкнутостью последних, отсутствием других электрогенных систем, действующих в плазмалемме нативной клетки (например, ЭТЦ), потерей плазма-леммой при выделении некоторых свойств, существенных для электрогенеза. Тем не менее проведение изучения электрогенных свойств Н+-АТФазы на таком уровне предстваляется важным и требует дальнейшего совершенствования.
Безусловно, значительным достижением следует считать развертывание исследований данного вопроса на еще более простой модельной системе — протеолипосомах со встроенной Н+-АТФазой. Впервые такое встраивание осуществлено Вара и Серрано [623, 682]. Исследованиями этих, а также других авторов 1460, 543] было показано, что даже в такой упрощенной системе Н+-АТФаза плазмалеммы проявляет основные свойства, характерные для нее в нативной мембране: ее активность подавляется ванадатом, ДЦКД, ДЭС, грамицидином S; имеет оптимум pH 6,5; стимулируется моновалентными катионами; ингибируется Са2+, Си2+; на нее практически не действует уабаин, олигомицин, азид. Но самое существенное состоит в том. что в протеолипосомах Н+-АТФаза сохраняет способность к АТФ-зависи-мому транспорту протона [460, 543, 623, 682]. При этом наряду с химической формируется и электрическая компонента ApLH+[637],
Таким образом, исследования, выполненные на везикулах плазматических мембран и липосомах, убеждают в том. что в формировании
электрогенной компоненты Е?т клеток высших растений существенная
роль принадлежит Н+-АТФазе. Однако, несмотря на большое удобство работы с этими системами, ситуация, существующая в них. значительно упрощена. Реальную оценку вклада Н+-АТФазы в формирование Ег„ необходимо исследовать с использованием также и интактных клеток.
Влияние ингибиторов Н+-АТфазной активности и прото-нофоров на потенциал покоя интактных клеток. Использование в опытах на интактных клетках физиологически активных соединений, ингибирующих Н+-АТФазу плазматических мембран высших растений in vitro (ДЦКД. ДЭС, ванадат и др.), в сочетании с соединениями, обладающими протонофорным действием (КЦХФГ, ДНФ и др.),
34
является эффективным методическим приемом установления причастности Н+-АТФазы плазмалеммы к формированию электрогенной
компоненты Ёт клеток высших растений in vivo.
Следует, однако, учитывать, что интерпретация влияния указанных выше соединений на ЕТЖ интактных клеток далеко не всегда
представляется столь однозначной, как в опытах на мембранных везикулах. Например, ингибирующее влияние на 1?т клеток со стороны
ДЦКД и ДЭС может быть обусловлено не только подавлением активности Н+-АТФазы плазмалеммы. но и в определенной степени угнетением клеточного метаболизма в целом [348]. В свою очередь, протонофоры способны снижать электрогенную компоненту Етт как
