Регулфяция метаболизма - Ньюсхолм Э.
Скачать (прямая ссылка):
а) Сравнение констант равновесия и отношений
действующих масс.
Константа равновесия реакции
А+ В с + D определяется из равенства
Г'.. [CIИ
[А] [В]
В большинстве экспериментов константа равновесия рассчитывается из концентраций субстратов и продуктов не при бесконечном разведении; в связи с этим рассчитанные константы обозначают как кажущиеся . константы равновесия (К'). Чтобы получить значение термодинамической константы равновесия (Keq), либо субстраты и продукты используют в концентрациях, приближающихся к бесконечному разведению, либо вместо концентраций в уравнение подставляют значения термодинамических активностей субстратов и продуктов, рассчитанные из концентраций. Некоторые экспериментальные методы определения К' рассмотрены в приложении 1.1.
Фермент является катализатором и, следовательно, не может изменять положение равновесия реакции. Если фермент катализирует равновесную (или почти равновесную) реакцию в клетке, то соотношение концентраций продуктов и субстратов должно быть близко к значению К' для этой реакции. Содержание в ткани субстратов и продуктов реакции может быть измерено, и отношение продукты/субстраты, которое оп-
ределяется как отношение действующих масс (обозначаемое греческой буквой Г), может быть рассчитано. Если величина Г не отличается от К', можно заключить, что эта реакция близка к Ьоложению равновесия в клетке. Однако, если полученное значение Г значительно меньше Кто реакция, вероятно, смещена далеко от положения равновесия, т. е. фермент катализирует в клетке неравновесную реакцию.
Измерение отношения действующих масс порождает ряд проблем, часть которых при полном понимании деталей экспериментального метода оказывается не очень серьезной. Измерение отношения действующих масс и обсуждение проблем, возникающих при интерпретации полученных данных, описаны в приложении 1.2.
б) Измерение максимальных активностей ферментов
Существование неравновесных реакций в метаболическом пути обусловлено следующим обстоятельством: фермент, катализирующий эту реакцию, недостаточно активен, чтобы обеспечить равновесие концентраций субстратов и продуктов. Ферменты предшествующего и последующего этапов обеспечивают образование субстрата и удаление продукта намного быстрее, чем происходит их взаимопревращение с участием «неравновесного» фермента. Такая ситуация лежит в основе второго метода идентификаций неравновесных реакций в метаболическом пути. В условиях in vitro определяют максимальные активности всех ферментов пути и на основании полученных результатов ферменты разделяют на две группы — низкоактивные и высокоактивные. Считают, что ферменты низкоактивной группы катализируют в клетке неравновесные реакции. Достоверные результаты могут быть получены только в том случае, если активность ферментов измеряют в оптимальных условиях и, следовательно, при наличии предварительной информации относительно свойств каждого фермента. Предпочтительно определять активность ферментов в неочищенном гомогенате, так как очистка может привести к потере активности; в некоторых случаях, однако, для получения достоверных данных может возникнуть необходимость в частичной очистке фермента.
Установлено, что активность этих двух групп ферментов различается, как правило, в 10—1000 раз. При существовании таких различий идентифицировать неравновесные реакции легко, так как в этом случае исключена возможность ошибочной классификации ферментов из-за маскирования их активности или из-за неадекватных условий измерения. При интерпретации результатов измерения ферментативной активно-
сти необходимо учитывать, что, если исследуемый фермент обладает высокой активностью, это еще не означает, что он обязательно должен катализировать равновесную реакцию in vivo: в условиях, существующих в клетке, его активность может быть в значительной степени ингибирована. Следовательно, такие данные по возможности должны быть подкреплены измерениями отношения действующих масс. Кроме того, в одних условиях фермент может катализировать равновесную „ реакцию, в других же условиях его активность может быть ингибирована на 95—99% и этот фермент, следовательно, будет катализировать неравновесную реакцию. В идеальном случае два метода идентификации неравновесных реакций должны обеспечить одинаковую классификацию. В действительности метод измерения отношения действующих масс должен отражать относительные ферментативные активности in situ, так как неравновесный характер реакции обусловлен низкой каталитической активностью по сравнению с активностью ферментов, катализирующих другие реакции.
Эти два метода широко использовались при анализе большинства исследованных на сегодняшний день метаболических путей. Однако следует остановиться и на двух других возможных подходах к решению проблемы идентификации неравновесных реакций.
в) Эксперименты по нагрузке
Потенциальные регуляторные реакции могут быть случайно установлены в результате измерения скорости синтеза продукта из различных промежуточных продуктов метаболического пути. Так, например, в метаболическом пути
