Регулфяция метаболизма - Ньюсхолм Э.
Скачать (прямая ссылка):
[15]. В фосфорилазе а из скелетной мышцы кролика этот пептид имеет структуру Сер-Асп-Глн-Глу-Лиз-Арг-Лиз-Глн-Иле-Сер (Ф) -Вал-Арг-Гли-Лей. Остаток серина, фосфор,илируемый при превращении b—*а, находится в участке пептидной цепи, обладающем сильно выраженными основными свойствами. Возможно, что -присоединение в этом участке фосфатной группы заметно сказывается на локальном заряде пептидной цепи и в результате —на конформации молекулы. Отрезок цепи, соответствующий выделенному пептиду, не принимает непосредственного участия в катализе: часть молекулы, остающаяся после его отщепления, сохраняет фосфорилазную активность. Эта часть, подобно целой молекуле фосфорилазы Ь, активна только в присутствии АМФ, но, конечно, не может превращаться ® фасфорила-зу а. Фосфорилируемый остаток серина, по-видимому, находится на поверхности белковой молекулы: он доступен для фосфатазы фосфорилазы а, для киназы фосфорилазы Ь, и он -легко доступен действию различных протеолетических ферментов.
Итак, мы знаем, что фосфорилируемый участок лежит на поверхности белка, что это определенный остаток серина, фос-форилирование которого, возможно, ведет к видоизменению локального (главным образом) положительного заряда, и что этот участок пространственно отделен от каталитического участка. Молекулярные детали, которые позволили бы объяснить повышение каталитической активности после фосфорили-рования данного остатка серина, пока неизвестны (см. обзор
[16]).
Как показало определение молекулярного веса, фосфорилаза b в своей активной форме представляет собой димер, состоящий из двух белковых субъединиц с одинаковым молекулярным весом 92 500. Кристаллическая фосфорилаза а из различных источников имеет молекулярный вес 370 000 и, следовательно, состоит из 4 таких субъединиц. Если очищенную фосфорилазу а дефосфорилировать с помощью фосфатазы, то
. НОч9,0-
I
о
сн2 о* л х.'мн
^тЛ1^ная Пептидная Цепь цепь
Рис. 38. Фосфорилирова«ныЗ остато-к серина.
происходит освобождение 4 моль неорганического фосфата на 1 моль фосфорилазы а и молекулярный вес белка уменьшается вдвое. Таким образом, in vitro мы имеем следующую стехиометрию:
Фосфорилаза а -. » 2 Фосфорилаза 6 -{- 4ФИ.
Недавние исследования группы Фишера показали, что это едва ли относится и к живой мышце, где фосфорилаза а, вероятно,
Фосфатаза
тт ш__________________________________ ?__________^
сг— ?
??
г-6-Ф
'АМФ
Г-1-Ф Г-6-Ф1
АМФ
Г-1-Ф
I
Киназа
Рис. 39. Схема структурных я конформационных изменений фосфорилазы [:1б].
Кружками представлены неактивные конформации, квадратами — активные конформации, светлыми кружками и квадратами показаны нефосфорилировакиые субъединицы, черными — фосфорнлированные.
находится в форме димера. In vitro обе формы фосфорилазы, а и Ь, могут существовать в виде мономеров, димеров и тетрамеров. Реагенты, взаимодействующие с сульфгидрильными группами, вызывают обратимую мономеризацию ферментного белка. Мономеры неактивны, тогда как димерные формы а и Ь могут быть при- надлежащих условиях активными. Фишер и его сотрудники предполагают, что фосфорилирование димера Ь в димер а происходит в два этапа, с промежуточным образованием «гибрида», в котором фосфорилирована только одна из двух субъединиц. Каждый димер может существовать в одной из двух конформаций, находящихся между собой в равновесии (рис. 39). У фосфорилазы Ъ это равновесие в отсутствие активаторов (АМФ, Фн) сильно сдвинуто в сторону неактивной конформации. Напротив, равновесие фосфорилиро-ванной формы (фосфорилазы а) благоприятствует образованию активной конформации. Киназа фосфорилазы Ь действует на неактивную конформацию, а фосфатаза фосфорилазы а — на активную конформацию. Активные конформации легко агрегируют; этим и объясняется то, что активная фосфорилаза
в, будучи выделена, оказывается тетрамером, так же как и
фосфорилаза Ь в присутствии АМФ. Хотя фосфорилазы а из скелетных мышц человека, кролика, крысы и лягушки легко агрегирует с образованием тетрамеров, этого нельзя сказать об исследованных до сих пор ферментах из других источников. Таким образом, образование тетрамеров, по-видимому, не обязательно для проявления каталитической активности.
2. СВОЙСТВА КИНАЗЫ ФОСФОРИЛАЗЫ 6
Киназа фосфорилазы Ь, выделенная из скелетной мышцы, обладает лишь очень слабой активностью. Ее можно активировать in vitro несколькими способами:
а) инкубацией с АТФ и ионами Mg?+;
б) инкубацией с ионами Са2+:
в) обработкой протеоли-тическим ферментам (например, трипсином) ;
г) увеличением pH примерно до 8,2.
Как полагают, воздействие трипсина и высокого pH не имеет никакого физиологического значения. Активация IB результате частичного протеолиза — процесс необратимый, и трудно .представить себе, чтобы он мог играть какую-то роль в регуляции активности фермента в мышечной клетке. Фермент, выделенный в яеакти-вированной форме, имеет оптимум pH более 8 и почти неактивен при pH 6,8. Даже при pH 8 эта неактивированная форма отличается от фермента, активированного другими способами (инкубацией с АТФ и Mg2+ или с Са2+); она мелее активна и при высоких значениях pH (рис. 40) *. Поскольку в клетке вряд ли
