Регулфяция метаболизма - Ньюсхолм Э.
Скачать (прямая ссылка):
Эксперименты по релаксации проводят следующим образом: создают условия для достижения равновесия между ферментом и субстратом, а затем состояние системы резко изменяют с чрезвычайно высокой скоростью (например, пропуская ¦через раствор высоковольтный разряд, в результате чего температура повышается на 10°С всего лишь за 1 мкс, — метод, получивший название «температурного скачка»). Переход к новому состоянию равновесия прослеживается методом быстрой кинетики. Каждая индивидуальная стадия в суммарной реакции характеризуется собственным временем протекания, которое является для данной стадии функцией константы скорости.
Киршнер и сотр. [20] использовали описанный метод для исследования дрожжевой глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназы, имеющей 4 центра связывания для НАД+. После установления равновесия между НАД+ и ферментом система •была возмущена методом температурного скачка, изменение
6—1100
связывания НАД+ регистрировали по изменению поглощения при 360 нм. Время протекания релаксации до установления нового равновесия может быть разделено на три различные временные шкалы (10~3, 10-2 и 1 с), на основании которых можно рассчитать индивидуальные константы скоростей для всех трех процессов (&i = 7000 с-1, &2 = 690 с-1, &3 = 0,2 с-1). Наиболее медленная константа скорости не зависит от концентрации белка или НАД+, тогда как две другие константы уменьшаются с увеличением концентрации НАД+. Полученные результаты можно объяснить следующим образом: две быстрые константы скорости отражают присоединение НАД+ ,к двум формам белка (т. е. к R и Т), а медленная константа относится j к процессу взаимопревращения этих двух форм (т. е. к обратимому переходу R=*±:T). Последний процесс, по-видимому, не будет зависеть от концентрации белка и НАД+. Эти данные свидетельствуют в пользу симметричной модели» поскольку «последовательная модель» предполагала бы существование по крайней мере четырех раздельных времен релаксации, зависимых от концентрации НАД+. Кроме того» на основании полученных результатов можно рассчитать все, 3 константы для модели Моно — Уаймана — Шанжё (т. е. Кя, Кт и L) и построить кривую зависимости Ys от [НАД+]. Такая теоретическая кривая находится в очень хорошем соответствии с экспериментально полученной кривой.
г) Взаимосвязь между конформацией
U частичным насыщением
В простой «последовательной модели» индуцированного соответствия присоединение субстрата вызывает изменение конформации белка. Следовательно, часть белка, находящегося в связанной с субстратом форме (т. е. степень изменения конформации), зависит от частичного насыщения белка субстратом. Однако в общей «последовательной модели» (расширенной модели Кошланда, см. рис. 9), включающей как частный случай симметричную модель, изменение конформации не зависит непосредственно от присоединения субстрата, так что степень изменения конформации не должна быть пропорциональна частичному насыщению. Это становится очевидным из уравнения, выведенного для симметричной модели.. Для тетрамерной молекулы частичное насыщение описывается уравнением (2.18)
и часть белка в R-форме (т. е. степень изменения конформации) определяется из следующего уравнения (см. приложение 2*2):
г: (ч-йГ
* (_‘+&М.+$г
Таким образом, R и Уэ будут изменяться независимо друг от друга, особенно при больших значениях члена уравнения
Были проведены исследования изменения конформацион-ного состояния гемоглобина при связывании кислорода [21]. Данные для Ys получили на основании исследования присоединения кислорода к гемоглобину, а для R— используя метод спинового резонанса. Изменения Ys и R были неодинаковы, кинетика реакции между кислородом и -гемоглобином, по-видимому, не соответствует простой модели Кошланда. Аналогично исследования АТКазы, при которых значение Ys опдеделяли по связыванию аналога субстрата (сукцината), a R оценивали либо по радиоактивности сульфгидрильных групп, либо методами седиментации, показали, что изменение .конформации может значительно превышать изменение частичного насыщения [22, 23].
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Свойства двух типов структурных моделей, предложенных для объяснения кооперативности, можно резюмировать следующим образом. Симметричная модель Моно — Уаймана — Шанжё основана на постулате, что в отсутствие лиганда по меньшей мере два симметричных конформационных состояния белка (R и Т) находятся в равновесии, причем равновесие сдвинуто в сторону Т-формы. Присоединение субстрата к любому протомеру в определенной форме никак не влияет на связывание субстрата остальными протомерами в той же форме (иными словами, в реакции между субстратом и протомерами в R-форме все микроскопические константы связывания одинаковы). Положительная кооперативность объясняется превращением Т-формы в R-форму (с которой преимущественно или даже исключительно связывается субстрат), так что равновесие между двумя структурными состояниями белка сдвигается в направлении формы, предпочтительно связывающей субстрат (т. е. в направлении R-формы).
