Регулфяция метаболизма - Ньюсхолм Э.
Скачать (прямая ссылка):
в) Качественное описание модели
При чисто описательном подходе можно указать нц. два вида отличий сигмоидной кривой от гиперболической: в первом случае начальное присоединение субстрата к ферменту мало по сравнению с тем, что наблюдается в случае гиперболической кривой, и, крометого, скорость связывания нарастает при более высоких концентрациях субстрата, так что кривая имеет точку перегиба. Первое отличие легко объясняется симметричной моделью. В отсутствие субстрата равновесие-R/T сдвинуто в сторону Т-формы. Следовательно, при низких концентрациях субстрата присутствует лишь незначительное-количество R-формы, способной связывать субстрат (если L = 103, только 0,1% фермента существует в виде R-формы в отсутствие субстрата). Концентрация R лимитирует образование RSi и т. д. Однако, по мере того как концентрация субстрата достигает величины, при которой он будет оказывать заметное влияние на образование RSi, RS2 и т. д., начинает сказываться влияние субстрата на все реакции, в результате' которых R превращается в RSi, RS2, RS3 и RS4 и таким образом удаляется из среды. По мере удаления R из равновесия* R^T некоторое' количество Т-формы будет переходить в R-форму, которая получит возможность взаимодействовать с новой порцией субстрата. Следовательно, равновесие R^T можно рассматривать в известной степени как буферную систему, поддерживающую концентрацию R-формы в достаточно постоянных пределах, несмотря на ее превращение в RSb RS2 и т. д.
Исходя из этой модели, можно довольно просто объяснить механизм действия активаторов и ингибиторов (математические выкладки см. в приложении 2.3). Предполагается, что ингибитор присоединяется преимущественно (или даже исключительно) к Т-форме и таким образом стабилизирует это состояние, что приводит к увеличению аллостерической константы L, а следовательно, и к усилению сигмоидной формы кривой. Подобным образом, если активатор присоединяется преимущественно (или исключительно) к R-форме, аллостериче-ская константа уменьшится и сигмоидность кривой будет* выражена в меньшей степени.
Симметричная модель объясняет в простой, изящной, доставляющей эстетическое наслаждение форме, как могла появиться кинетика аллостерических ферментов. Однако исследователь в своих научных изысканиях не должен руководствоваться соображениями эстетического характера, поэтому не удивительно, что было проведено много экспериментов, с тем чтобы установить: 1) действительно ли симметрия имеет
тенденцию сохраняться в аллостерических ферментах вообще или нет, 2) применима ли эта модель только к некоторым ферментам и неприменима к другим и 3) не дает ли более общая последовательная модель Кошланда более верного метода описания аллостерических систем. Подробное обсуждение таких экспериментов составило бы отдельную книгу, но и оказалось бы мало полезным в общем учебнике.
Однако в общих чертах мы рассмотрим типы экспериментальных подходов, которые можно использовать, чтобы различать симметричные и последовательные модели.
Существуют три типа экспериментов, на основании которых можно подтвердить или опровергнуть симметричную теорию:
а) доказательство кинетики по типу модели Хилла, б) доказательство отрицательной кооперативности и в) изучение кинетики релаксации. Кроме того, может быть использован четвертый тип исследования для подтверждения или опровержения последовательной теории Кошланда о простом индуцированном соответствии, включающем взаимоотношение между изменениями конформации и связыванием субстрата.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ ДВУМЯ МОДЕЛЯМИ
а) Кинетика «по типу модели Хилла»
Симметричную модель аллостерических белков можно рассматривать как частный случай последовательной модели, так же как модель Хилла представляет собой частный случай более общей модели Адайра. Обязательным допущением в модели Хилла является существование только двух форм белка: полностью насыщенного субстратом и совершенно свободного. Уравнение, описывающее частичное насыщение в этих условиях, тождественно уравнению (2.12) (уравнение Хилла)
В определенных ситуациях уравнение, описывающее модель Моно — Уаймана — Шанжё, упрощается до уравнения Хилла. Если субстрат присоединяется только к R-форме белка,
При очень больших значениях аллостерической константы L (т. е. если преобладает форма белка, не связывающая субст-
V A [Jf-
s 1 •
у __K[ST
рат), [S]/CrS>1 для большинства значений Уэ, отложенных на графике против [S], и уравнение принимает упрощенный вид
т. е. получим уравнение Хилла.
Для некоторых аллостерических белков очень большие значения L можно получить сведением аллостерического ингибитора, который присоединяется исключительно к Т-форме и приводит к увеличению значения. L. При этих условиях только малая часть белка будет находиться в R-форме, которая будет практически полностью насыщена субстратом даже при низких концентрациях последнего. Таким образом, полностью выполняется условие Хилла: белок присутствует только в Т- и RSn-формах. Следовательно, в рассмотренной ситуации график зависимости log7s/(l—Уэ) от log[S] (или для фермента: logt>/(Kmax—и) от log[S]) должен быть линейным с наклоном, равным числу связывающих участков. Однако число связывающих участков (обозначаемое иногда q) должно быть измерено независимым способом. Иными словами, если будет показано, что наклон на «графике Хилла» соответствует независимо определенному числу связывающих участков для S, симметричную модель можно считать доказанной. Этот экспериментальный вывод можно использовать только при положительных результатах. Несоответствие величины п числу связывающих участков не исключает возможности существования симметричной модели (например, связывание S может оказаться неисключительным или значение аллостерической константы может быть недостаточно велико даже в присутствии высоких концентраций ингибитора).
