Регулфяция метаболизма - Ньюсхолм Э.
Скачать (прямая ссылка):
лением о регуляции концентрацией субстрата. Следует подчеркнуть, что непосредственная причина, вызвавшая изменение концентрации субстрата, не важра и ни в коей мере не влияет на интерпретацию данных.
При интерпретации результатов таких экспериментов следует учитывать два важных момента. Во-первых, нельзя делать заключения, что фермент не является регуляторным (в соответствии со вторым определением); если поток и концентрация субстрата изменяются в одном и том же направлении, это не доказывает, что регуляция осуществляется только концентрацией субстрата. Фермент может регулироваться и изменением концентрации субстрата и с помощью специфического регулятора. Во-вторых, под термином «субстрат» в этом определении следует понимать только субстрат данного метаболического пути, а не кофактор или альтернативный субстрат (как, например, АТФ или НАД+). Субстрат метаболического пути можно определить как субстрат, который непосредственно модифицируется ферментом и с которого начинается поток, вещества через метаболический путь.
' б) Значение теоремы о пунктах перекреста
в метаболическом контроле
Применение рассмотренного выше подхода (изменение уровня потока и промежуточных соединений в стационарном состоянии для идентификации пунктов регуляции или торможения) впервые подробно рассмотрели Чанс и др. [13] при изучении системы транспорта электронов и окислительного фосфорилирования. Эти исследователи предложили теорему
о пунктах перекреста, согласно которой ингибирование метаболического пути на какой-то специфической стадии должно приводить к увеличению концентрации субстрата и уменьшению концентрации продукта и vice versa. Такая закономерность действительно наблюдается в дыхательной цепи, с той лишь разницей, что изменяются не концентрации ее компонентов, а степень их окисленности. Следовательно, увеличение концентрации окисленной формы должно приводить к уменьшению концентрации восстановленной формы. Концепция о пунктах перекреста была затем использована для идентификации регуляторных ферментов, но в этом случае изменение концентрации продукта во внимание не принимается. Все, что требуется для анализа регуляторных ферментов, — это установить неравновесный характер реакции и показать, что концентрация субстрата этой реакции изменяется в направлении, противоположном изменению потока (см. работу Роллестона [12]).
3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕГУЛЯТОРНЫХ ФЕРМЕНТОВ
При наличии данных, подтверждающих, что «неравновесный» фермент в действительности является регуляторным (т. е. что его активность изменяется под влиянием факторов, отличных от соответствующего субстрата), можно рассчитывать на успешную идентификацию метаболического регулятора (регуляторов) при систематическом изучении свойств фермента in vitro. На первых этапах проверяют действие субстрата, продукта, кофакторов и т. п.; после этого необходимо найти эффекторы, молекулы которых могут быть и лишены химического сходства с молекулами субстрата или продукта. Часто такой поиск сводится к применению метода проб и ошибок, хотя природа эффектора может быть предсказана путем внимательного рассмотрения соответствующего метаболического пути и его связи с другими путями.
Экспериментальные условия, в которых ведут исследование регуляторных ферментов, в каждом конкретном случае определяются особенностями исследуемого фермента. Обычно фермент экстрагируют из ткани в среду, в которой он сохраняет максимальную каталитическую активность. Однако часто бывает трудно оценить, какая степень очистки исходного экстракта необходима или желательна для изучения свойств фермента. Должен быть достигнут какой-то компромисс между использованием неочищенных экстрактов, в которых с наибольшей вероятностью сохранены важные для регуляции свойства фермента, и очисткой фермента, облегчающей проведение детального кинетического анализа. Слишком высокая степень очистки может привести к изменению или даже исчезновению важных регуляторных свойств. Следовательно, начальные этапы исследования ферментов должны проводиться в настолько грубых системах, насколько это возможно, для того чтобы обеспечить достоверное измерение активностей.
4. ФОРМУЛИРОВАНИЕ ТЕОРИИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ
Как только регуляторные ферменты идентифицированы и их свойства изучены, становится возможным постулировать теорию контроля. При формулировании теории слёдует помнить о двух моментах, которые очень просты, но которые тем не менее часто выпадают из поля зрения. Во-первых, теория должна быть такой, чтобы вытекающие из нее предсказания можно было проверить экспериментально, так как постулирование теории метаболической регуляции, которая не может быть проверена (либо из-за своей чрезмерной сложности, либо из-за методических трудностей), не представляет большой ценности. Во-вторых, теория должна соответствовать боль-
шинству известных физиологических фактов, связанных с исследуемым метаболический/ путем.
Основной недостаток такого общего подхода к изучению метаболической регуляции состоит в том, что теория строится на экстраполяции свойств изолированных ферментов к свойствам ферментов в неизвестных условиях интактной клетки: предполагается, что факторы, влияющие на активность фермента in vitro, будут оказывать сходное действие и в клетке.
