Цитологія, гістологія, ембріологія - Новак В.П.
Скачать (прямая ссылка):
Із фіксованого шматочка вирізають тоненьку пластинку (не тонше 2—3 мм), змочують її достатньою кількістю води і кладуть на заморожувальний столик мікротома. За допомогою мікрометричного гвинта (від руки) заморожувальний столик разом із шматочком підводять якомога ближче до ножа, ніж відводять назад і, злегка притискуючи пальцем шматочок до столика, починають заморожувати об'єкт дослідження. Для цього відкривають кран (біля столика) і випускають вуглекислоту з перервами, поперемінно відкриваючи та закриваючи кран.
Про заморожування об'єкта свідчить його побіління, яке починається від основи. Як тільки це проявиться, палець від шматочка тканини забирають. У подальшому, з метою більш рівномірного і швидкого заморожування об'єкта, а також економної витрати вуглекислоти, столик мікротома рекомендується прикривати металевим ковпачком, який додається до мікротома, перевернутою склянкою або ж м'якою серветкою, складеною в кілька шарів. При цьому серветку добре притискують рукою.
Коли весь шматочок побіліє, приводять у рух ніж, якому попередньо надають необхідний кут нахилу. Спочатку відшліфовується поверхня шматочка, для чого найкраще використовувати кінчик ножа. Столик із шматочком подають за допомогою мікрогвинта знову від руки, але дуже обережно, оскільки під час зрізування товстих пластинок можна легко зірвати об'єкт. Як тільки поверхня шматочка стає рівною, ніж зміщують з таким розрахунком, щоб об'єкт різався його середньою частиною, і переходять на автоматичну подачу. Попередньо потрібно перевірити показник товщини зрізів.
Ніж обов'язково рухають до кінця в один і другий бік, інакше подача буде неповною. На заморожуючому мікротомі зви-
*Цитологія, гістологія, ембріологія *
чайно одержують зрізи товщиною 10—15, а якщо об'єкт не дозволяє, то товщиною 20—25 мкм. Дуже міцні тканини, наприклад, декальциновані кістки чи тверді фіброми, рекомендується приморожувати до столика зі шматочком змоченого фільтрувального паперу, підкладаючи його під об'єкт. Цей технічний прийом забезпечує краще примерзання шматочка тканини. Зрізи знімають з ножа щіточкою і переносять у чашку з водопровідною водою.
Якісні зрізи отримують лише при правильному заморожуванні шматочків тканин. При перемерзанні об'єкта зрізи кришаться, а недостатнє заморожування замість зрізів дає зскрібок. Якщо шматочок перемерзає, різання потрібно припинити і почекати поки він розморозиться. Заморожені зрізи можна тривалий час зберігати у 5—10%-ному розчині формаліну.
Спосіб заморожування шматочків вуглекислотою є ідеальним, але, на жаль, не завжди доступним (див. додаток рис. 2). У зв'язку з цим, слід використовувати новий метод заморожування об'єктів — за допомогою простої охолодженої суміші льоду і солі, запропонований П. П. Поповичем, яку зберігають у спеціальному столику, сконструйованому автором.
Заливка тканин та виготовлення зрізів
Зневоднення. Якщо матеріал після фіксації підлягає заливці (крім желатинової), то наступним етапом є зневоднення його у спиртах зростаючої концентрації. Шматочки тканин зневоднюються одразу (якщо проводилася фіксація формаліном) чи після 24—48-годинної промивки у проточній воді. Зневоднення у спиртах проводиться з метою підготовки тканини до просочення целоїдином і парафіном. Щоб одержати високий ступінь зневоднення, необхідно мати не 2, а 3 чи 4 склянки з якісними спиртами зростаючої міцності, в яких шматочки слід витримувати по 24 години в кожній. Краще і швидше процеси зневоднення та знежирювання проходять у термостаті при температурі 37—40°С.
11
*Цитологія, гістологія, ембріологія *
12
Методика заливки в целоїдин
Виготовлення розчинів целоїдину. Целоїдин є одним із різновидів чистої колоїдної нітроклітковини. Його випускають у вигляді желатиноподібних напівпрозорих пластин, які упаковують у залізні коробки. Таку пластинку потрібно вийняти з коробки, порізати на дрібненькі шматочки і висушити між листами фільтрувального паперу в термостаті з температурою 37°С або при кімнатній температурі. З висушеного целоїдину готують два розчини абсолютного спирту, розведеного наполовину ефіром: один — густий, з консистенцією меду (8—10 %-ний), другий — рідкий, з консистенцією гліцерину (4—5%-ний). Розчиняється сухий целоїдин у суміші абсолютного спирту з ефіром протягом кількох днів, тому краще готувати розчину більше і мати його про запас. Зберігають целоїдин у широкогорлих склянках із притертими корками.
Шматочки тканин після зневоднення у спиртах з метою кращого знежирювання протягом 6—24 годин обробляють також сумішшю спирту (99 чи 100°) з ефіром (наполовину). При фіксації в ацетоні об'єкти можна зразу ж переносити в розчин целоїдину, який є надзвичайно чутливим до жиру, тому може міститись у шматочках навіть після якісного зневоднення. Із суміші спирту з ефіром (іноді навіть із 96°-ного чи абсолютного спирту) шматочки тканин переносять у рідкий розчин целоїдину на 2—3 дні, а потім у густий на 1—2 дні. Більш тривале перебування в будь-якому розчині целоїдину не шкодить шматочкам: вони тільки краще ним просочуються. Після просочення в целоїдині проводять ущільнення шматочків. З цією метою їх переносять у маленьку чашечку (бюкса), де їх акуратно розкладають, а потім заливають свіжою порцією густого целоїдину з таким розрахунком, щоб над шматочками був шар целоїдину товщиною 0,5 см. Чашечку накривають кришкою і підкладають під кришку смужку паперу, складену вже у 2—3 шари. Протягом 2—3-х днів (залежно від густоти целоїдину та швидкості випаровування спирту й ефіру) целоїдин поступово висихає й ущільнюється. При цьому його поверхня в чашечці знижується до рівня шматочків. Процес ущільнення проводиться під ковпа-
