Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Мазин А.В. -> "Методики для работ по генетической инженерии" -> 14

Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.

Мазин А.В., Кузнеделов К.Д. Методики для работ по генетической инженерии — Новосибирск, 1986. — 61 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikidlyarabotgenetiche1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 8 9 10 11 12 13 < 14 > 15 .. 16 >> Следующая

Модификация по пиримидиновым основаниям "Т+С"
Нанесите на de 81 целлюлозу 5,5 мкл гидразингидрата. Реак-
секвестрование ДНК
50
цию проводите 7+10 мин. Остановите реакцию добавлением 200 мкл этанола.
Модификация по цитозину "С"
Нанесите на DE 81 целлюлозу 3,5 мкл 1,5+2% ЯаОН в гид-разингидрате. Реакцию проводите 7+10 мин. Остановите реакцию добавлением 200 мкл этанола.
Отмывка ДЭАЭ-целлюлозы от химических реагентов
а) Перенесите DE 81 целлюлозу с иммобилизованной ДНК, модифицированной по "G" и "A+G" в этанол I, промокнув предварительно на фильтровальной бумаге.
б) Перенесите DE 81 целлюлозу с иммобилизованной ДНК, модифицированной по "С" и "Т+С" последовательно в ацетил-ацетон I, ацетилацетон 2 и этанол I, промокая перед каждым перенесением на фильтровальной бумаге.
в) Промойте DE 81 целлюлозу этанолом I и водой последовательно 5 раз и затем водой 5 раз, промокая после каждой промывки на фильтровальной бумаге, и перенесите в этанол 2. Промокните на фильтровальной бумаге и высушите на воздухе.
Гидролиз ДНК по местам специфических модификаций
Перенесите кусочки DE 81 целлюлозы в эппендорфоские пробирки. Прилейте в каждую пробирку 100 мкл пиперидина и инкубируйте 30 мин при 95°С. Затем отмойте в большом объеме вода (100 мл) и 5 мл этанола, промокая после каядой промывки на фильтровальной бумаге. Высушите на воздухе.
Десорбция ДНК с DE 81 целлюлозы
Поместите DE 81 целлюлозу в 50 мкл 2 М ЫаС1 20 мМ ЭДТА в эппевдорфовских пробирках и инкубируйте 20 мин при 70°С. Затем аккуратно перенесите DE 81 целлюлозу в другие пробирки с 50 мкл 2 М ЫаС1 20 мМ ЭДТА и снова инкубируйте 20 мин при 70°С. Аккуратно удалив DE 81 целлюлозу, объедините содержимое обеих пробирок.
секвенирование ДНК
51
Осаждение ДНК
Добавьте в каждую пробирку по 200 мкл этанола, заморозьте в жидком азоте (30 сек) и центрифугируйте 5 мин. Осадок промойте 50 мкл 70% этанола и центрифугируйте I мин. Аккуратно удалив супернатант пипеткой, высушите осадки.
Осадки растворите в 2 мкл буфера, содержащего:
80% формамид
50 мМ трис-борат pH 8,3
I мМ ЭДТА
0,1% ксиленцианол
Электрофорез проводите в 34-12% полиакриламидном геле (в зависимости от величины фрагмента), содержащем 8 М мочевину, в ТВЕ буфере. Толщина геля 0,2+0,3 мм. Длина стекол 40+80 см. Напряжение 1,5+3 кВ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Жидкие среды
Среда LB (Luria-Bertani)
На I я:
Бакто-триптон Бакт о-дрожкевой NaCl
10 г
экстракт 5 г 10 г
Доведите pH до 7.5 2 М ЫаОН.
Среда М9
На I л:
Ыа2НК>4 6 г
кн2ро4 3 г
НаС1 0,5 г
ВН.С1 I г
4
Доведите pH до 7.5, проавтоклавируйте, охладите и добавьте следующие компоненты:
I М *gS04 2 мл
20%-ная глюкоза 10 мл
Три последних раствора стерилизуйте по отдельности фильтрованием (раствор глюкозы) или автоклавиро ваниен.
Эту среду используют для хранения и разведения фага.
1 И CaCl
2
I мл
Среда SM
На I л:
NaCl
jigS04*TH20
1 и трис-HCl pH 7,5 2%-ный желатин
5,8 г 2 г 50 мл 5 мл
приложение_____________53
Рестрикционная карта ДНК-плазмиды pBR322
Плазмидный вектор для клонирования в E.coli. Кольцевая молекула ДНК длиной 4363 пар оснований. Начало репликации ДНК (ori) из Со1Е1 производной рМВ1. Генетические маркеры: Тс (ген устойчивости к тетрациклину) из pscioi, Ар (ген устойчивости к ампициллину) из транспозона ТпЗ. Отсчет нуклеотидной последовательности от первой Т в уникальном EooRl-сайте (...GAATTC...) в направлении от Тс к Ар. При определении первичной структуры ДНК pBR322 (Sutcliffe, 1979) была упущена буква С в 526 положении.
EcoHi 4361 23
приложение___________________54
43б3/п
приложение_____________65
Размеры фрагментов рестрикции плазющы pBR322
Alu I Haelll(BspRI) Нра II
910 .... 587 ....
659 .... 540 .... ... 2
655 .... .. 3 504 ....
521 .... .. 4 458 .... .. 4 309 .... ... 4
403 .... 434 .... 242 ....
281 .... .. 6 267 .... .. 6 238 ....
257 .... 234 ....
226 .... .. 8 213 .... .. 8
136 .... 192 .... .. 9 ... 9
100____ ..10 184 .... ..10 180 .... ...10
63 .... ..II 124 .... . .Ila 160 .... ,..IIa
57____ ..12 123 .... ..116 ...116
49____ 104 .... ..12 ,..128
19 .... 89 .... ..13 ,..126
15 .... ..15 80____ ..14
II •••• ..16 64---- ..15 no ....
Предыдущая << 1 .. 8 9 10 11 12 13 < 14 > 15 .. 16 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed