Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Мазин А.В. -> "Методики для работ по генетической инженерии" -> 13

Методики для работ по генетической инженерии - Мазин А.В.

Мазин А.В., Кузнеделов К.Д. Методики для работ по генетической инженерии — Новосибирск, 1986. — 61 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikidlyarabotgenetiche1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 7 8 9 10 11 12 < 13 > 14 15 .. 16 >> Следующая

4. В пробирку с фрагментом добавьте около 50 мкг тРНК-но-сителя и 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия, перемешайте и расфасуйте в 4 пробирки для реакций.
5. В каждую пробирку добавьте 2,5-3 объема этанола, заморозьте в жидком азоте, дайте оттаять (лучше при -20°С) и центрифугируйте 5 мин. Спирт удалите с помощью водоструйного насоса, осадки высушите.
секвенирование ДНК_______________46
Химические реакции расщепления ДНК
Кодификация по гуанину (Реакция G)
1. К 95 мкл воды добавьте 5 мкл диметилсульфата, тщательно перемешайте.
2. Осадок ДНК в одной из пробирок растворите в 20 мкл воды и добавьте 5 мкл 5%-го раствора диметилсульфата. Инкубируйте в зависимости от длины фрагмента от 10 сек (фрагменты до 2000 пар) до 2 мин (около 100 пар).
3. Добавьте 300 мкл 2/6-го раствора перхлората лития в ацетоне, переменяйте и центрифугируйте 30 сек.
4. Супернатант осторожно (!) удалите автоматической пипеткой.
5. Осадок промойте ацетоном и 96%-ным этанолом и подсушите.
Модификация по пуринам (Реакция A+G)
1. Осадок ДНК растворите в 8 мкл воды и добавьте 16 мкл концентрированной муравьиной кислоты. Инкубируйте в 2 раза дольне, чем в реакции "G".
2. Осаждение и промывки - как в реакции "G".
Модификация по пиримидина* (Реакция Т+С)
1. К осадку ДНК прибавьте 15 мкл гидразина или гидразин-гидрата, инкубируйте на шейкере в три раза дольше, чем в реакции "A+G".
2. 0саащение и промывка как в предыдущих реакциях.
секвенирование ДНК
47
Модификация по цитозину (Реакция С)
1. К осадку ДНК добавьте 15 мкл 3 М раствора хлористого натрия в гидразингидрате. Инкубируйте на шейкере как в реакции "Т+С".
2. Добавьте 300 мкл 2%-го раствора перхлората лития в ацетоне, перемешайте и центрифугируйте 30 сек. Выпадает белый плотный осадок.
3. Супернатант удалите пипеткой, а к осадку добавьте 300 мкл 70%-го этанола. Осадок тщательно суспендируйте и центрифугируйте 30 сек.
4. Осадок промойте 96%-ным этанолом, высушите.
Гидролиз пиперидином
1. Приготовьте 10%-ный раствор пиперидина в воде по количеству образцов (на I образец - 100 мкл). Пиперидин необходимо вливать под воду.
2. Добавьте во все пробирки по 100 мкл 1056-го пиперидина, инкубируйте на кипящей бане 15 мин.
3. Добавьте во все пробирки по I мл 2%-го перхлората лития в ацетоне, перемешайте, плотно закрыв крышку пробирки.
4. Центрифугируйте 30 сек, супернатант осторожно удалите автоматической пипеткой.
5. Осадки дважды промойте ацетоном и один раз этанолом.
6. Осадки высушите и растворите в формамиде, содержащем ксиленцианол и бромфеноловый.синий. Количество формами-да для растворения образца определяйте уровнен радиоактивности. Для определения уровня радиоактивности пробирку поместите в сцинтилляционный флакон (пустой) и просчитайте в %-канале счетчика. Для работы используйте образец с радиоактивностью около 20 тыс. имп./мин в 2-3 мкл раствора.
секвенирование ДНК
48
Метод определения нуклеотидной последовательности ДНК
по Максаму-Гнлберту на твердой фазе
(Чувпило, Кравченко, 1983)
Электроэлюция ДНК из геля на ДЭАЭ-целлюлозу
. I. Обработка ДЭАЭ-целлюлозы.
ДЭАЭ-целлюлозу DB-8I (примерю 100 см*") инкубируйте в 20 мл раствора ДНК из тимуса теленка (100 мкг/мл) в течение 10 мин. Избыток ДНК отмойте в 100 мл Н20, затем проинкубируйте целлюлозу при легком покачивании (на шей-кере) в 20 мл 2 М ЫСю^ в течение 20 мин, отмойте в 100 МЛН2О и высушите на воздухе. ДЭАЭ-целлюлоза может использоваться в течение года.
2. Фрагмент ДНК, меченный ^2Р по 3'-концу вырежьте из геля (после препаративного электрофореза) и с помощью электроэлюции в ТБЕ буфере перенесите на предварительно обработанную DE-81 целлюлозу.
3. После электроэлюции DE 81 целлюлозу с иммобилизованным фрагментом ДНК промойте последовательно 5 мл 20 мМ ЭДТА pH 8,0, 5 мл этанола и высушите на воздухе.
Реакции химического расщепления ДНК
Высушенную DE 81 целлюлозу разрежьте на 4 части с соотношением радиоактивности I / 2'/ 2 / I (для проведения соответственно реакций G / G+A / Т+с / с).
Модификацию ДНК проводите в планшете для иммунологических реакций (96 лунок), приготовленном для этого согласно
секвеннрование ДНК_____________49
(D(D(3)®(D(3)®(D®®(D(D
©оо©оо©©©©©©
G G+A Т+С С
1 - DE 81 целлюлоза с иммобилизованной ДНК
2 - Этанол I (200 мкл)
3 - Этанол 2 (200 мкл)
4 - Н20 (200 мкл)
5 - Ацетилацетон I (50 мкл)]
}¦ 5% ацетилацетон в этаноле
6 - Ацетилацетон 2 (50 mo)J
Специфические модификации ДНК
Модификация по гуанину "G"
Нанести на DE 81 целлюлозу 3,5 мкл свежеприготовленного 1% диметилсульфата в 50 мМ формиата аммония pH 3,5. Инкубируйте 40+60 сек. Остановите реакцию добавлением 200 мкл 5/6 раствора 2-мер капт о э тан о ла в этаноле.
Модификация по пуриновым основаниям "A+G"
Нанесите на DE 81 целлюлозу 5,5 мкл 66% муравьиной кислоты. Реакцию проводите 2,5+4 мин. Остановите реакцию добавлением 200 мкл этанола.
Предыдущая << 1 .. 7 8 9 10 11 12 < 13 > 14 15 .. 16 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed