Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
60 предимплантационных эмбрионов на одну дорожку, а в случае двумерных
гелей это количество возрастает до 250 эмбрионов. Метод (основанный па
работе [29]) излагается в табл. 8.10.
236
Глава 8
Таблица 8.10. Окрашивание гелей серебром
1. После электрофореза и фиксации (в смеси: 45% метанол : 10% уксусная
кислота) отмывайте гель в 50%-ном метаноле не менее 30 мни, затем в
дистиллированной воде (3x30 мин). Эта процедура обеспечивает полное
удаление таких примесей, как глицерол и тритон.
2. Окрашивайте каждый гель в течение 15 мин в свежеприготовленном
растворе аммиачного нитрата серебра (0,8 г нитрата серебра в 4 мл биди-
стиллированной воды плюс 21 мл 0,36%-ного NaOH и 1,4 мл раствора аммония;
довести объем до 100 мл бидистиллированной водой).
3. Тщательно промойте гель бидистиллированной водой (3x2 мин).
4. Проявляйте в течение 8-15 мин в 500 мл раствора, содержащего 0,05
мг/мл лимонной кислоты и 0,18 мг/мл раствора формальдегида, затем
перенесите в 50%-ный метанол (30 мин), 20%-ный метанол или би-
дистиллнрованную воду (2X45 мин).
5. Высушите гель и сфотографируйте.
4.3. Выявление специфических белков
Для выявления специфических полипептидов было предложено несколько
методов окрашивания [2]. Так, использование меченых лектинов дает
возможность идентифицировать и частично охарактеризовать гликопротеины,
находящиеся в гелях. Существуют разнообразные способы выявления лектинов
- прямые, если лектины конъюгированы с флуоресцентным красителем [30] или
пероксидазой хрена [31], или косвенные - с помощью антилектиновых антител
[32]. Эти методы пока не находят широкого применения при анализе белков
ранних эмбрионов.
Для выявления специфических белков после электрофореза могут быть
использованы антитела, однако скорость диффузии антител в гелевый матрикс
очень низка. В связи с этим разработаны разнообразные способы переноса
белков из полиакриламидных гелей в нитроцеллюлозные [33]. Для
иммуноблоттин-га используют поликлональную антисыворотку и некоторые
моноклональные антитела, способные узнавать антиген, несмотря на его
денатурацию. Взаимодействие антиген - антитело выявляется либо путем
мечения антитела (обычно ,251), либо посредством амплификации с вторичным
или третичным антителом. В настоящее время известно несколько систем
амплификации:
а) вторичное антитело, связанное с пероксидазой хрена,, выявляется при
инкубации с 3,3-диаминобензидином и перекисью водорода в виде окрашенной
полосы Г35];
б) меченое вторичное антитело обеспечивает более высокую чувствительность
либо прямо (благодаря метке), либо при связывании с первичным
иммуноглобулином ,251-ме-ченого белка А из S. aureus [36];
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мышн________________237
Таблица 8.11. Идентификация специфических белков методом вестерн-блот
Определение специфических белков требует большого числа яиц или раиних
эмбрионов (так, для приготовления исходного белкового препарата при
разделении в одномерном геле нужно взять 800-1000 иеоплодотворенных
яиц на одну дорожку геля).
1. Проведите предварительное вымачивание полоски бумаги Biodyne или
нитроцеллюлозы, вырезанной по размеру гелевой пластинки, и двух полосок
ватмановской фильтровальной бумаги большего размера в буфере, содержащем
2 мМ ацетата натрия, 5 мМ MOPS и 20% этанола (если используется
биодииовая бумага) или в буфере, содержащем 25 мМ трис (pH 8,3), 192 мМ
глицина и 20% метанола (если используется нитроцеллюлоза) .
2. Сразу после электрофореза поместите гель на бумагу, предназначенную
для переноса белков (блот) и заключите между двумя полосками
фильтровальной бумаги. Весь пакет поместите в аппарат для переноса (Bio-
rad Trans-Blot Cells), убедившись в том, что блот направлен к
положительно заряженному электроду. Наполните резервуар тем же буфером, в
котором вымачивались полоски бумаги. Перенос белков осуществляется при
50/60В в течение 2 ч или при ЗОВ в течение ночи.
С!. После переноса выньте блот (гель можно сохранить, чтобы
проконтролировать полноту переноса белков с помощью окрашивания серебром,
см. табл. 8.10).
4. Блокируйте сайты неспецифического связывания белковых молекул путем
встряхивания препарата в течение иочн с 10% ЭТС, 3% БСА или с 10%-ным
раствором обезжиренного молочного порошка в солевом растворе,
забуферениом фосфатом (PBS : 0,14 М NaCI, 2,7 мМ КС1, 1,5 мМ К.Н2РО4, 8,1
мМ Na2HP04, куда добавляется 0,02-0,1% азида натрия).
5. Споласкивайте блот в течение 10 мин в PBS, содержащем 0,1% Тритона Х-
100 или 0,1% твина. Эту процедуру следует проводить при каждом
промывании.
Н. Разведите первичное антитело1* в соответствии с требованием
(разведение зависит от специфичности антитела; моноклональные антитела,
например, часто используются неразведеннымн) в 3%-ном БСА в PBS и
инкубируйте в течение 45-60 мни в закрытом контейнере небольшого объема
(0,5- 2 мл). Тщательно отмойте блот (4X10 мин) прежде, чем инкубировать
его с вторичным антителом.
". В качестве вторичного антитела используйте 5 мкл нужным образом био-
