Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
способность метода. По сравнению с радиоавтографией флюорография
234
Глава 8
повышает эффективность выявления 3Н в 1000 раз, a 35S и 14С в 15 раз с
незначительной потерей разрешения. В последнее время трудоемкий метод
импрегнации 2,5-дифенилоксазолом в диметилсульфоксиде ([2, 26]) в большой
степени вытеснен использованием готовых препаратов, таких как Enhance,
Autof-luor, Enlightening и Amplify. Мы обычно применяем Amplify
(Amersham), который оказался надежным и чувствительным. В этом случае
гели следует перенести из фиксирующей смеси прямо в Amplify (достаточно
его количество, покрывающее гель, - это около 16 мл), встряхивать 15-20
мин, а затем высушить в условиях постоянного вакуума при 60-80 °С на
фильтровальной бумаге. Важно, чтобы вакуум поддерживался до тех пор, пока
гель не высохнет полностью, иначе он может треснуть. Чтобы не ошибиться в
содержимом каждого геля, воспользуйтесь радиоактивным маркированием
(и/или системой нумерации) гелей. Это можно сделать, обмакнув карандаш с
волокнистым концом в чернила, к которым добавлено немного жидкости,
содержащей 14С или 35S (такие "горячие" карандаши можно приобрести у
фирмы Amersham). Чтобы повысить чувствительность медицинской фотопленки,
ее засвечивают вспышкой белого света длительностью около 1 мсек; это
увеличивает поглощение на 0,1-0,2 А540 единиц по сравнению с
неэкспонированной проявленной пленкой. Оптимальное расстояние между
фотопленкой и источником, вспышки и время вспышки определяют
экспериментально [2J.
Изображение, полученное на фотопленке после проявления, может быть
сфотографировано и/или сканировано с помощью денситометра, что дает
возможность количественно оценить результаты. В продаже имеются различные
сканирующие устройства, которые можно приспособить для сканирования одно-
и двумерных гелей прямо (после окрашивания или путем сканирования при 280
нм) или получив их радиоавтографическое изображение [3J. Применение
сканирующего устройства для двумерных гелей необходимо сопровождать
компьютерным анализом результатов. Соответствующие программы можно
приобрести (например, приборы и программы Joyce - Loebl). При работе с
одномерными гелями вместо сканирования применяют другую процедуру;
влажный гель нарезают на пластинки и с помощью сцинтилляционного счетчика
определяют содержание радиоактивного белка в каждой из них [2].
Теоретически этот подход мог бы быть использован в экспериментах с
двойным мечением, если бы разрешение не было ограничено размером
пластинки. Более высокое разрешение достигается тщательным выбором
изотопов, выявляемых в интактном геле,
Как уже упоминалось в разд. 2.1.2, существует метод, позволяющий
различать 14С- и 3Н-меченные белки [5, 6]. Для об-
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мыши
235
нарушения обоих изотопов гель флюорографируют и экспонируют с
предзасвеченной фотопленкой при -70 °С. Параллельно проводят прямую
радиоавтографию на неэкспонированной фотопленке при комнатной температуре
для выявления только 14С. Этот метод не удобен в том отношении, что
требует длительной экспозиции из-за низкой удельной активности изотопов
[3J. Сочетание [35S]-метионина и [765е]-селенометионина позволяет быстро
различить две популяции новосинтезированных белков, включающих разные
относительные количества каждого из изотопов. Радиоактивность геля
регистрируют на двух отрезках предварительно засвеченной рентгеновскими
лучами пленки, разделенных засвеченной и проявленной (почерневшей)
пленкой. При такой экспозиции на первой пленке будет зарегистрировано
излучение обоих изотопов, но на вторую, отделенную засвеченной
прокладкой, проникнет только более мощное ^-излучение 75Se (оно может
быть усилено применением интенсифицирующего экрана). Если на первой
пленке будет зарегистрирована полоса среди белков, меченных 35S,
положение этих белков на второй пленке можно установить путем сравнения
первого негатива со вторым.
4.2. Окрашивание общих белков
Наиболее известный краситель - кумасси ярко-голубой R-250 способен
выявлять 0,2-0,5 мкг белка в резкой полосе (см. работу [2J); к сожалению,
для обнаружения очень малых количеств белка ранних эмбрионов он
недостаточно чувствителен. В связи с этим была усовершенствована методика
окрашивания серебром f28, 29]. Авторы сообщают о ее высокой
чувствительности (в 100-200 раз выше, чем чувствительность предыдущего
метода) и пригодности для анализа белков раннего эмбриона. Вопрос о том,
применима ли эта методика для количественного анализа, оказался спорным
[3]. По нашему мнению, при достаточной осторожности в оценке
сверхокрашен-ных полос и при использовании эталонных белков,
нормализующих при разделении плотность других пятен, этот метод может
обеспечить количественный интегральный анализ денситометри-ческим
сканированием.
При выявлении белков методом окрашивания серебром для приготовления
белкового препарата в случае одномерного геля требуется материал примерно
