Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 92

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 162 >> Следующая

Дезаэрация
Персульфат аммония (мкл) ТЭМЕД (мкл) 45 15 30 20
ционной толщины (0,8 мм) уменьшен объем растворов и сокращено время
процедуры. Последнее усовершенствование связано с использованием системы,
разделяющей белки в горизонтальных, а не вертикальных пластинах (приборы
LKB); привлекательность этой системы обусловлена тем, что она значительно
сокращает время разделения и процессинга и позволяет осуществлять как
электрофорез в ПААГ, так и ИЭФ.
Источник и чистота ингредиентов, используемых при электрофорезе, во
многом определяют его разрешающую способность. Исходные растворы
необходима готовить каждые 1-2 месяца и хранить как описано в табл. 8.4 и
8.7.
Недостаток одномерных гелей заключается в том, что число белков, которые
можно разделить с их помощью, весьма ограниченно. Для двумерных гелей эта
цифра значительно больше благодаря тому, что разделение полипептидов
происходит в соответствии и с их нзоэлектрической точкой, и с
молекулярной массой. Таким образом, двумерные гели могут идентифицировать
до 1000-1200 индивидуальных белков (см. рис. 8.3). Однако и им
свойственны недостатки. Они связаны с длительностью процедуры, трудностью
интерпретации п плохой воспроизводимостью.
3.1. Одномерные гели
Распределение белков в результате гель-электрофореза зависит от
концентрации акриламида, но, к сожалению, ни одна его концентрация не
может обеспечить равномерность распределения. По-видимому, наилучшее
разрешение дает гель с экспоненциальным градиентом. Подробности работы с
таким гелем (8-15%) описаны [4] и здесь не будут обсуждаться. С 10%-ным
акриламидным гелем работать проще, он дает более рав-
Таблица 8.6. Приготовление, загрузка и использование одномерных гелей
1. Ополосните две чистые пластинки 70%-иым спиртом и высушите
непосредственно перед употреблением.
2. Поместите тефлоновые спейсеры (0,8 мм толщиной и ~8-10 мм шириной)
между пластинками с каждой стороны. По нижиему краю между стеклянными
пластинками пропустите узкий (отверстие 0,5 мм; стейка 0,25 мм) шлаиг нз
силиконовой резины (ESCOLta), который, изгибаясь U-образио, должен
подниматься по боковым граням пластинок снаружи от спейсеров. Скрепите
пластники зажимами. Убедитесь в том, что поверхность геля горизонтальна.
3. Приготовьте смесь нижнего, разделяющего геля (см. табл. 8.4 и 8.5) из
исходного раствора акриламида (А), буфера иижиего геля н биди-
стиллироваииой воды и дезаэрируйте. (Неполимеризованный акриламид
обладает иейротоксическими свойствами, обращаться с осторожностью.)
Добавьте 10%-ный персульфат аммония, затем ТЭМЕД.
4. Залейте гелевую смесь между стеклянными пластинками так, чтобы уровень
был иа 15-25 мм ниже верхнего края меньшей из пластинок. Наслоите сверху
1 мл 1-бутаиола, насыщенного водой. В верхнюю часть конструкции вставьте
"гребенку" для формирования лунок, она должна располагаться над уровнем
покрывающего раствора, чтобы не нарушить расположения пластинок. Оставьте
гель на 1 ч для полимеризации. Если гель не предназначается для
непосредственного использования, замените покрывающий раствор
бидистиллированной водой или буфером нижиего геля, разбавленным ,в четыре
раза, заклейте липкой лентой, чтобы предотвратить испарение, и оставьте
при 4°С (до 24 ч).
5. Наполните нижний резервуар прибора буфером для разделения (табл. 8.4).
6. Удалите гребенку, покрывающий раствор и сполосните верх геля водой.
Осторожно осушите (ие повредив поверхности полимеризоваииого геля)
плотной фильтровальной бумагой.
7. Уберите шлаиг и поместите пластинки в сосуд, наклонив их и осторожно
погружая одним концом, чтобы свести к минимуму число пузырьков воздуха
под гелем.
8. Приготовьте концентрирующий гель (см. табл. 8.4 и 8.5) из исходного
раствора акрнламида, буфера верхнего геля и бидистиллированной воды,
дезаэрируйте. Добавьте 10%-иый раствор персульфата аммония, затем ТЭМЕД,
Наслоите эту смесь поверх иижиего, разрешающего геля и вставьте
тефлоновую гребенку, формирующую лунки. Полимеризация заканчивается через
30 мин.
9. Уберите гребенку. Удалите иеполяризоваииую смесь (это удобно делать с
помощью шприца с тонкой иглой). В верхний резервуар залейте буфер для
разделения, заполните лунки.
10. Убедитесь в том, что удалены пузырьки воздуха в буфере для разделения
под гелем; это делается с помощью струи такого же буфера, выпущенной из
шприца , снабженного загнутой иа конце иглой.
И. Выпрямите стороны лунок и пометьте их маркирующим карандашом иа
передней пластинке. Загрузите образцы гамильтоновским шприцем. Перед
внесением очередного образца шприц должен быть хорошо отмыт от
предыдущего.
12. Проведите электрофорез меченых и немеченых маркеров молекулярной
массы иа каждом геле. Загрузите по 10 мкл буфера для образцов в пустые
лунки, фланкирующие образцы, для устранения краевого эффекта.
13. Несколько капель бромфенолового синего можно добавить и верхний
резервуар в качестве лидирующего красителя.
14. Проводите электрофорез при постоянном напряжении 150 В или при
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed