Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
метионином. Этот прием дополнит информацию, полученную в результате
импульсного мечения [15].
224
Глава 8
2.4. Гликопротеины
Гликозилированные белки можно осадить специфическими лектинами. Однако
эта методика требует большого числа эмбрионов, поэтому мы ее не
предлагаем [16J. Гликопротеины могут быть также идентифицированы после
электрофореза (см. разд. 4.3) или путем метаболического мечения
радиоактивными сахарами. К сожалению, большинство сахаров плохо проникает
в эмбрионы вплоть до стадии бластоцисты. Ранние эмбрионы можно пометить,
например, [3Н]-глюкозамином, но анализ меченых белков потребует слишком
большого числа эмбрионов (см. работу [17J).
Гликопротеины, синтезированные бластоцистами, могут быть помечены
фукозой, маннозой или глюкозамином. Бластоцисты следует отмыть в среде
без глюкозы (см. гл. 2, разд. 5.2, оптимальная среда для культивирования
бластоцист), но с добавлением альтернативных субстратов, таких как
пируват, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота [18]. Группы из 15-
60 бластоцист могут быть помечены в течение 3-6 ч в 50 мкл среды без
глюкозы, содержащей БСА и около 25 мкКи лиофи-лизированных [3Н] -
глюкозамина, pHj-маннозы или [14С]-фу-козы (с удельной активностью 2-50
мкКи/мл). Затем эмбрионы следует отмыть, проведя через несколько капель
среды без метки, несколько капель среды без БСА и до электрофореза
хранить в буфере для образцов (см. разд. 3.1). Важно удалить сыворотку,
так как большие количества немеченого белка будут нарушать структуру
геля.
2.5. Выявление синтеза специфических белков
Особые белки, синтезируемые или накопленные ранним эмбрионом, могут быть
обнаружены в результате комбинированного применения специфических антител
и иммунофлуоресценции, иммунопреципитации или иммуноблоттинга. Для
непрямой иммунофлуоресценции эмбрионы фиксируют и окрашивают
(соответствующие методические приемы приведены в гл. 2, разд. 4). К
сожалению, количество белка, необходимое для анализа методами
иммунопреципитации и блоттинга, может быть обеспечено только большим
числом эмбрионов. Блоттинг описан в разд. 4.3.
Иммунопреципитация предполагает идентификацию синтезированных
специфических белков посредством их осаждения антителами [16]. Наиболее
часто используемый прием осаждения комплекса антиген - антитело включает
связывание с белком A Staphylococcus aureus. (В тех случаях, когда
антитело получено от вида, не связывающего белка А, преципитация ин-
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мыши
225
Таблица 8.3. Иммуиопреципитация
1. Пометьте эмбрионы [358]-метионииом, как рекомендуется в разд. 2.1.1.
2. Отмойте эмбрионы от среды, содержащей БСА, и соберите их в 200 мкл
свежеприготовленного буфера1*. Радиоактивность 1-2Х106 имп/мин иа образец
дает хорошие результаты. Для этого может потребоваться от 1 до 2000
бластоцист, меченных в течение 3 ч при удельной активности, указанной в
разд. 2.1.1.
3. Прокипятите образец в течение 1-2 мии и храните при -70 °С. Все
дальнейшие процедуры следует делать иа льду.
4. Непосредственно перед использованием сонируйте образец, чтобы
тщательно разрушить клетки. Сохраните небольшой объем (10 мкл) в качестве
контроля при -70 °С. Оставшуюся часть образца разделите иа две порции.
о. Центрифугируйте образцы, специфическую аитисыворотку и контрольную
сыворотку при 15К в течение 15 мии.
6. Добавьте равные объемы специфической или контрольной сыворотки к двум
эмбриональным образцам. Оптимальное разведение специфической сыворотки
варьирует в зависимости от антитела и устанавливается в каждом случае, но
оно должно быть таким же, какое используется для им-му нофлуоресцеиции.
7. Подготовка гранул белкаА с сефарозой: промойте 500 мг гранул восемь
раз в 5 мл буфера для отмывки (100 мМ трис, pH 8,3; 2 мМ ЭДТА; 0,5%
дезоксихолата натрия; 0,5% Nonidet Р-40 (NP-40); 0,1% ДСН). Всякий раз
центрифугируйте с небольшой скоростью и полученный осадок
ресуспендируйте. В последний раз к осадку добавьте равный объем буфера (~
2 мл) - теперь гранулы готовы к работе.
8. Для каждого из образцов отцентрнфугируйте по 100 мкл приготовленных
гранул, супернатант отбросьте, а смесь белок/аититело добавьте к образцу.
9. Встряхивайте эту смесь на льду (энергично, чтобы гранулы ие оседали) в
течение 2 ч. Затем четыре раза отмойте в 100 мл того же буфера. Для этого
центрифугируйте 2 мии иа малой скорости и ресуспендируйте осадок
(использовать вортекс не нужно). Наконец, внесите 100 мМ трнс pH 8,3 для
последней отмывки и осадите.
10. Соберите специфический белок-антиген с гранул кипячением с 50 мкл
буфера для образцов (табл. 8.4) в течение 3 мии. Отсосите раствор
микропипеткой (Eppendorf), опустив ее конец иа дно каждой пробирки.
Храните при -70 °С до электрофоретического разделения (см. разд. 3.1).
'> 100 мМ трис pH 8,3; 2 мМ ЭДТА; 0,5% дезоксихолата натрия; 0,5% Nonidet
Р-40 (NP-40); 0,5% ДСН. Перед употреблением добавить 10 мМ иодацетамида,
1 мМ ФМСФ, I мкг/мл пепстатина, 1 мкг/мл лейпептина, Ю мкт/мл апротинина.
