Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
(каждая аминокислота в концентрации 100 мкМ).
3. Культивируйте эмбрионы в течение определенных промежутков времени в
той же среде. Обмен немеченых аминокислот с эндогенными аминокислотами
[9] способствует выведению меченого метионина из пула свободных
аминокислот в клетках.
222
Глава 8
Таблица 8.1. Неметаболическое мечение белков
1. Отмойте эмбрионы (или единичный эмбрион) от БСА и поместите в 10 мкл
0,1 М боратиого буфера с pH 8,5 в эппендорфовскне пробирки. Образцы можно
хранить при -70 °С.
2. Приготовьте реактив Болтона и Хантера. Фирма Amersham поставляет
реактив в бензине. Дайте бензину испариться, а затем растворите реактив в
боратиом буфере. Каждая ампула содержит количество реактива, достаточное
для иодирования 20-30 образцов.
3. Внесите реактив Болтона и Хантера в образцы и оставьте иа 20 мин при
комнатной температуре.1* Поскольку белка в эмбрионах очень мало, объем
добавляемого реактива не имеет значения (в любом случае он окажется в
избытке).
4. Добавьте 9 объемов этанола температуры льда и оставьте белки для
осаждения на 2 ч при 4°С.
5. Отцентрифугируйте образцы в микроцентрифуге (Eppendorf) в течение 10
мин, отбросьте супернатант и дайте осадку высохнуть. Растворите сгусток в
буфере для приготовления образца (табл. 8.4) и до электрофореза храните
при -70 °С (см. разд. 3.1).
J) См. работу [ 13].
4. Сравните путем электрофореза белки сразу после мече-
ния с образцами, полученными в конце периода наблюде-
ния. Изменения в мобильности белков указывают на их
посттрансляционную модификации?.
2.2. Неметаболическое мечение общих белков
Неметаболическое мечение существующих белков (в отличие от
метаболического мечения белков синтезирующихся) представляет собой более
чувствительный метод, чем окрашивание белков в геле (см. разд. 4.2).
Меченый материал отделяется путем гель-электрофореза и выявляется
радиоавтографичес-кп. Теоретически можно было бы пометить только белки
клеточной поверхности, например, воспользовавшись непроникающей белковой
меткой-[14С]-изоэтионилацетимидатом [11] - или путем иодирования,
катализируемого лактопероксидазой
[12]. Однако важнейшим условием эксперимента является сохранение
нормальной жизнеспособности клеток, поэтому подобные процедуры требуют
большой осторожности и включения надежного контроля.
Для мечения общих белков при физиологических условиях можно использовать
[14С]-этилацетимидат, проникающий в
клетки без нарушения функций мембраны [11]. Другой метод заключается в
использовании N-сукцинимидильной группы ре-
актива Болтона и Хантера [М-сукцинимидил 3-(4-гидрокси-5-
[,251 (-иодофенил)пропионат], конденсирующейся со свободны-
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мыши
22а
Таблица 8.2. Дефосфорилироваиие фосфопротеииов
1. Введите метку, инкубируя эмбрионы в течение 1 ч в среде с [:!3S]-Mei
ип-нином (как в разд. 2.1), затем отмойте нх, проведя через несколько
капель среды М2 или Ml6 без БСА.
2. Контрольную группу меченых эмбрионов поместите прямо н буфер для
образцов (табл. 8.4).
3. Перенесите остальные три группы эмбрионов в 5 мкл бидистиллированной
воды и оставьте иа 30 мин для лизиса при -70 °С.
4. Разморозьте один лизироваииый образец и инкубируйте при 37 °С в
течение 1 ч с фосфатазой (иапрнмер, со щелочной фосфатазой. Sigma) при
конечной концентрации 5 мкг/мл (0,3 едииицы/мл).
5. Разморозьте следующие два контрольных образца и инкубируйте - один с 5
мкл 2 мМ феиилметилсульфонилфлуорида (ФМСФ, ингибитор протсаз). а другой
только с 5 мкл бидистиллированной воды.
6. Внесите в каждый образец буфер для образцов с удвоенной концентрацией
ДСН. Храните образцы при -70°С до электрофореза (см. разд. 3.1).
ми аминогруппами полипептидов [13]. В этом случае информативен такой
порядок нанесения образцов на гель, при котором можно сравнивать на
соседних дорожках паттерн синтезированных белков (метаболически меченных
[358]-метионином) с белками, существующими (неметаболически
меченными125!) иа данной стадии эмбриогенеза. Методика неметаболического
мечения белков представлена в табл. 8.1. При работе с ,251 не забывайте о
технике безопасности.
2.3. Фосфопротеины
Фосфопротеины можно идентифицировать по включению меченого фосфата.
Эмбрионы культивируют в течение 2 ч в бесфосфатной среде (гл. 2, разд.
5.2, М16 без КН2РО4), содержащей 1 мКи/мл [32Р]-ортофосфата без носителя
(Amersham International pic.). Перед употреблением 32Р лиофилизируют и
растворяют. Фосфат включается слабо, особенно в период пп-терфазы,
поэтому для одномерного анализа требуется 100- 150 эмбрионов (см. рис.
8.1). Возможно, в будущем окажется более удобным инъецировать метку
непосредственно в цитоплазму ранних эмбрионов по аналогии с
экспериментами на яйцах Xenopus [14].
Чтобы убедиться в том, что меченые белки были действительно
фосфорилированы протеинкиназами, следует провести обработку
протеинфосфатазами, как описано в табл. 8.2. Тогда фосфатные группы будут
удалены и электрофорез обнаружит сдвиг в положении полос, меченных [35S]-
