Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 88

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 162 >> Следующая

мечення; с особой осторожностью нужно относиться к оценке белков, имеющих
низкое содержание метионина, например гистонам. В качестве метки могут
быть использованы и другие аминокислоты - индивидуально или в смесях.
Способы двойного мече-
Качественный анализ белков раиних эмбрионов мыши
219
а 6 в г
Рис. 8.4. Сравнение аккумулированных белков с синтезированными в раннем
эмбрионе, показано на одномерном геле. Паттерн белков эмбрионов 2-клеточ-
ион и 4-клеточной стадий развития, меченных [^S]-метионином, представлен
на дорожках а и а, паттерн белков, окрашенных серебром (ОС), - на
дорожках б и г.
220
Глава 8
ния (включение двух разных аминокислот, каждая из которых содержит
различные радиоизотопы) описаны в работах [5-7]. Двойное мечение
применяется для определения различий по типам синтезированных белков в
разное время или в разных компартментах раннего эмбриона (см. также разд.
4.1). Ряд посттрансляционных модификаций может быть выявлен по гжлючению
меченых сахаров или фосфата. Использование специфических антител дает
возможность определить синтез (посредством иммунопреципитации; разд. 2.5)
или присутствие (посредством иммуноблоттинга; разд. 4.3) анализируемых
белков.
2.1. Метаболическое мечение общих белков
2.1.1. Прямое мечение
Яйца или эмбрионы инкубируют в культуральной среде М16, содержащей БСА
(см. гл. 2, разд. 5.2), в которую добавлены меченые аминокислоты,
например, [35S]-метионин, [3Н]-лейцин или смеси [3Н]- или [14С/-
аминокислот. Культивирование эмбрионов в радиоактивной среде в течение 1-
5 ч не влияет на результаты анализа. Однако жизнеспособность эмбрионов
при длительном культивировании в присутствии даже такой малой дозы,
как'50 мкКи/мл [35S]-метионина, значительно снижается [8]. Учитывая
высокую удельную активность [35S]-метионина ( - 1300 Ки/ммоль) достаточно
добавления 1-3 мкл меченой аминокислоты к 50 мкл (120-360 мкКи/мл)
культуральной среды (см. рис. 8.1, 8.2 и 8.3). Если в качестве метки
используют другие аминокислоты, целесообразно порцию меченой аминокислоты
лиофилизировать, а затем снова растворить ь меньшем объеме культуральной
среды. Этот прием обеспечит более высокую концентрацию изотопа; например,
50 мкл [3HJ-лейцина (удельная активность -100 Ки/мМоль) можно
лиофилизировать и снова растворить в 25 мкл культуральной среды. Важно,
чтобы мечение производилось в среде, лишенной примесей немеченых
аминокислот, так как последние снизят удельную активность меченых. Кроме
того, следует иметь в виду, что присутствие сыворотки в метящей среде
тоже может снизить концентрацию изотопа. Низкие эндогенные пулы
метионина, лейцина, фенилаланина и аланина в клетках раннего эмбриона
дают этим меченым предшественникам преимущество при выборе [9].
2.1.2. Мечение двойным изотопом
Распознавание двух различных популяций новосинтезнро-ванных белков можно
осуществить на основе использования двух различно меченых аминокислот
(разные способы обсужда-
Качественный анализ белков ранних эмбрионов мыши
221
ются в работе [3J). Так, мечение одной популяции эмбрионов смесью [|4С]-
аминокислот, а другой популяции - смесью PH] -аминокислот должно выявить
любые различия в обоих наборах новосинтезированных белков ([5, 6]; см.
разд. 4.1). Быстрый и эффективный способ двойного мечения эмбрионов дает
комбинация [35SJ-метионина и источника ^-излучения [758е]-селенометионина
- изотопов, обладающих высокой удельной активностью. Каждой аминокислотой
можно пометить две группы эмбрионов и, вычислив радиоактивность (см.
разд. 2.7), загрузить гель смесями в соответствующих пропорциях. Чтобы
избежать артефактов, следует использовать ре-ципрокные комбинации обоих
образцов, меченных каждым из. изотопов.
2.1.3. Импульсное мечение
Паттерн синтезируемых белков раннего эмбриона в значительной степени
обусловлен посттрансляционной модификацией первичных продуктов
трансляции. Эксперименты с импульсным мечением позволяют выявить
"медленные" модификации (модификации, происходящие почти сразу после
отделения первичного продукта от рибосомы, не определяются). Смысл этой
методики заключается в том, чтобы пометить белки и проследить их судьбу в
ходе последующей инкубации. Перед внесением меченой аминокислоты в среду
важно снизить ее активность (путем лпофилизации и растворения в большем
объеме), иначе эмбриональное развитие в период инкубации может быть
нарушено, в частности, затормозится дробление зародыша [8]. Обычно
используемая процедура [Ю] описана ниже.
1. Введите импульсную метку, инкубируя эмбрионы в течение 1 ч в
культуральной среде М16+БСА (гл. 2, разд. 5.2), содержащей [358]-метионин
и 1 -10 мкМ немеченого метионина. Метка должна обладать удельной
активностью около 10 Ки/ммоль, но учитывая длительность последующей
инкубации, ее следует снизить до 1 Ки/ммоль.
2. Отмойте эмбрионы от метки, проведя их через несколько капель среды М16
+ БСА, в которую добавлены немеченые метионин, фенилаланин и лейцин
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed