Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Гель-систему следует изначально калибровать на чувствительность, точность
реагирования на активность внесенного фермента, на разрешающую
способность в отношении минорной полосы в смеси, активность которой
известна, и на воспроизводимость. Для этого приготовьте тканевые
экстракты животных, несущих разные аллели фосфоглицераткиназы и проведите
спектрофотометрический анализ фермента, чтобы с помощью гель-системы
тестировать смеси известных пропорций и известной активности.
Спектрофотометрический анализ ФГК-1 описаи в разд. 3.5, а
чувствительность, разрешение и точность можно определить, руководствуясь
разд. 3.6-3.8. В этом разделе описаны сканирование и количественное
определение.
1. Проинкубируйте гель в течение 8-10 мин до начала измерений, чтобы
проявились флуоресцирующие полосы. Источник УФ-излучения также к этому
времени должен быть разогрет.
2. Поместите гель на движущийся конвейер и сканируйте флуоресценцию вдоль
каждой дорожки. Повторите ска-
14-171
210
Глава 7
нирование в течение различных интервалов времени-до 30 мин. Типичный гель
и временная регистрация флуоресценции для эмбриональных образцов
представлены на рис. 7.8 (А и Б).
3. Вклад обоих изозимов и активность ФГК-1 в эмбриональных образцах
вычислены путем интеграции площадей под пиками. Если используется
самописец, пики можно тщательно вырезать и взвесить; активность ФГК-1 в
данное время для данной полосы изозима пропорциональна весу пика.
Графическое изображение веса пиков в зависимости от длительности
окрашивания для четырех искусственных смесей (см. разд. 3.8, ниже)
показано на рис. 7.8, В. Временная зависимость выхода NADPH имеет
линейный характер, для точной оценки пропорций присутствующих энзимов
достаточно 4-6 сканирований. Вместо вырезания и взвешивания площадей
пиков можно воспользоваться денситометром FTR-20, который присоединяется
к интегратору (Shimadsu C-R3A Chromatopac), компьютер даст
интегрированные значения областей под пиками.
4. Общая активность ФГК-1 на образец получается путем сравнивания с
известными эталонами, как описано ниже.
3.5. Спектрофотометрический анализ активности ФГК-1
Метод спектрофотометрического анализа соответствует описанному Харрисом и
Хопкинсоном [35].
1. Для каждого анализа реакционная смесь содержит:
100 мкл 1,0 М трис-HCl буфера, pH 8,0 (Sigma);
270 мкл дистиллированной воды;
400 мкл 20 мМ ATP (Sigma);
100 мкл 0,1 М хлорида магния (BDH);
10 мкл ГФД (Sigma);
100 мкл 2 мМ NADH (Sigma);
Субстрат-фосфоглицероловая кислота - готовится в виде 0,1 М раствора в
дистиллированной воде.
2. Внесите 10 мкл экстракта в 980 мкл реакционной смеси без субстрата в
чистой кварцевой кювете и эквилибри-руйте при 37 °С в течение 3 мин в
спектрофотометре (Cecil СЕ272), чтобы на самописце регистрировалась
прямая основная линия.
3. Внесите 10 мкл раствора субстрата, тщательно перемешайте пастеровской
пипеткой и измерьте снижение оптической плотности (АОП) при 340 нМ на
самописце (Ser-voscribe RE54) после двухминутной эквилибровки. Линейная
реакция длится 20-30 мин.
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК_________________211
Рис. 7.9. Разрешающая способность электрофореза в целлогеле при
разделении изозимов ФГК-1. Четыре искусственных смеси изозимов ФГК- 1А и
ФГК-1 Б тимоцитов мыши разделяли в целлогеле в соответствии с описанием,
данным в тексте. Активность ФГК-1А в смесях выражается следующим образом
(в %): 50% (дорожка 1), 20% (дорожка 2), 5% (дорожка 3) и 1% (дорожка 4).
Минорная полоса изозима ФГК-1А, четко выявляемая этим методом, составляет
всего 1 % от общей активности.
4. Активность ФГК-1 в мкмоль/мин/мл получена делением АОП/мин/мл на
6,22 (коэффициент молярной экстинкшш для NADH составляет 6,22хЮ3 при 340
нМ).
3.6. Чувствительность целлогель-электрофореза в отношении ФГК-1
Чувствительность гель-электрофореза и процедуры окрашивания тестируется с
использованием различных разведений тканевого экстракта.
1. Измерьте активность ФГК-1 в исходном образце на спектрофотометре.
2. Рассчитайте активность в разбавленных образцах, нанесенных на гель.
Например, экстракт мышиных фиброблас-тов (ЗХЮ6 кл/мл) с известной
активностью 500 нмоль/ч на 10 мкл, разведен в 200 раз, и 0,5 мкл этого
разведения показали различимую активность на геле. Отсюда нане-
14*
212
Глава 7
Рис. 7.10. Активность ФГК-1 в единственном ооците мыши, полученном от
самки, гетерозиготной по аллелям Pgk-la и Pgk-lb
сенная активность составит 0,125 нмоль/ч, что соответствует активности,
экстрагированной примерно из семи клеток. Серия таких экспериментов
позволила заключить, что наименьшая из различимых активностей ФГК-1
составляет около 0,05 нмоль/ч [33].
3.7. Разрешение минорной полосы
Рис. 7.9 демонстрирует результаты анализа смеси экстрактов из тимоцитов
линий мышей, различающихся по вариантам ФГК. Спектрофотометрический
анализ показал, что исходная активность ФГК-1 в каждом образце составляет
900 нмоль/ч на 10 мкл. На гель были нанесены четыре искусственные смеси с
