Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 84

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 162 >> Следующая

NAD Boehringer 9 мг
Ф руктозо -дифосфат Boehringer 220 мг
Красящий раствор В
Триэтаиоламии (50 мМ), pH 7,6 Sigma 5 мл
Глюкоза BDH 135 мг
ADP Boehringer 60 мг
NADP Boehringer 165 мг
MgS0;-7H20 BDH Analar 160 мг
Красящий раствор Г
Альдолаза Boehringer 20 мкл
Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа Boehringer 20 мкл
Глицсрол-фосфат-дегидрогеназа Boehringer 10 мкл
Глицеральдегид-З-фосфат-дегидрогеназа Sigma 10 мкл
Гексокиназа Boehringer 10 мкл
206
Глава 7
Рис. 7.7. Установка для электрофореза ФГК-1 в целлогеле. 1. Полоски
целлогеля в метаноле. 2. Полумикроаппликатор. 3. Сканирующий денситометр
Sigma FTR-20. 4. Ватмаиовский резервуар для электрофореза. 5. Опорный
мостик для геля. 6. Резервуар с водой при 20 °С, циркулирующей через
опорный мостик. 7. Черный пластиковый лоток для окрашивания и стеклянная
крышка. 8. Источник питания. (Фотография любезно предоставлена П. Мен-
денс.)
10 мин. Плавающий на поверхности гель должен равномерно пропитаться
буфером.
2. Промывайте гель еще 10 мин в 250 мл буфера для проведения
электрофореза, содержащего 25 мг дитиоэритрито-ла. Поскольку это
соединение нестойкое, его следует добавлять непосредственно перед
использованием. Дитио-эритритол выполняет роль стабилизатора фермента.
Осторожно покачайте сосуд для лучшей гидратации геля.
3. Перелейте этот буфер после второго промывания в ватма-новский
контейнер для проведения электрофореза, наклонив его, распределите буфер
равномерно но двум отсекам - анодному и катодному.
4. Внесите 45 мг АМР в катодный сосуд. (АМР, связываясь с
аденилаткиназой, заставляет ее перемещаться впереди ФГК-1 и покидать
гель; в противном случае аденплатки-наза будет при окрашивании
реагировать с ADP и АТР.)
5. Поместите гель на охлаждаемом мостике в контейнер, присоедините
электроды к источнику питания и проведите преэлектрофорез при 20° и 200 В
в течение 10 мин.
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
207
6. Разведите образец, если требуется, буфером для образцов (габл. 7.1).
Буфер для образцов содержит глицерол, уменьшающий испарение.
7. Наберите аппликатором четыре пробы образца (Cellogel semi-micro four-
piece applicator, Whatman) и нанесите на полоску целлогеля со стороны
катода. В случае эмбрионов в микрочашках и других микрообразцов маленькие
капли супернатанта по 5 мкл или менее наносите, воспользовавшись
пастеровской пипеткой с оттянутым кончиком, прямо на гель. Объем
наносимой пробы можно определить, поместив пипеткой такой же объем
жидкости в микрочашку Drummond на 1 мкл.
8. Проводите электрофорез в течение 1,5 ч при 200 В при 20 °С.
3.3. Окрашивание
Следует подчеркнуть, что соблюдение чистоты и аккуратности - необходимое
условие получения хороших результатов при окрашивании. К целлогелю и
целлограмме нельзя прикасаться руками, стеклянную пластинку и поднос
нужно брать только за края. Еще более важно очистить опорное и
прикрывающее стекло от пыли нефлуоресцирующей бумагой (бумажным фильтром
Whatman), так как пыль дает флуоресценцию. Одним пинцетом берите гель до
окрашивания, другим - окрашивающую целлограмму. Реактивы для
приготовления красящих растворов перечислены в табл. 7.1.
1. Приготовьте 660 мкл красителя за 5 мин до окрашивания, смешав:
400 мкл красящего раствора А;
200 мкл красящего раствора Б;
50 мкл красящего раствора В;
10 мкл красящего раствора Г.
Вылейте краситель в черный пластиковый поднос, по размеру соответствующий
полоске целлогеля.
2. Вырежьте листок целлюлозно-ацетатной бумаги - целлограмму (Cellogram;
Shandon Southern, 57X127 мм) по размеру черного пластикового подноса с
красителем и погрузите в краситель.
3. Отделите гель бритвенным лезвием от опорного мостика в контейнере и
положите лицевой стороной вниз на пропитанную красителем целлограмму так,
чтобы не было пузырьков воздуха. Прикройте поднос чистым стеклом.
208
Глава 7
1 2 3 4
Рис. 7.8. Разделение путем электрофореза в целлогеле и количественная
характеристика искусственных смесей изозимов ФГК-1. А. Электрофорез в
целлогеле. По данным спектрофотометрического анализа, процентное
выражение активности ФГК-1А до смешивания следующее: дорожка 1 -15%,
дорожка 2 - 30%, дорожка 3 - 40%, дорожка 4 - 50%. 1А и 1Б - указывают иа
миграции ФГК-1А и ФКГ-1Б. Б. Регистрация изменения флуоресценции (уве-
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
209
в '
Время (мин)
12 3 4
личение площади пика по мере окрашивания) на дорожках, представленных на
А. В. Зависимость активности ФКГ от времени, основанная на данных Б.
Значения вклада активности ФГК-lA (в %) в смесях 1-4, полученные в
результате флуорометрической оценки геля, соответственно равны: 16,3+1.4;
31,8+1,8, 42,0±0,6 и 52,5±0,9. Таким образом, количественные
характеристики, полученные в результате разделения в целлогеле, хорошо
согласуются с данными о составе искусственных смесей, полученными методом
спектрофо-
тометрии.
3.4. Количественный анализ активности ФГК-1 и пропорции обоих ферментов
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed