Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
выражающие зависимости активности от времени, свидетельствуют об
активности ФГК-1 в образце.
Мы проверили эффективность электрофореза в целлогеле и количественного
определения ФГК-1, использовав тканевые экстракты линий мышей PGK-1A и
PGK-1B. Значения активности ферментов в экстрактах сначала были
установлены путем спектрофотометрических измерений, затем ферменты
смешивали в разных соотношениях и наносили на гель. Регистрировали
следующие параметры.
1. Калибровка. Гель-система может быть калибрована при помощи образцов
известного объема и активности и определения количества изозимных полос.
Это позволяет прямо на геле оценить как общую активность ФГК-1, так и
пропорцию двух изозимов.
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
203
Рис. 7.6. Измерение флуоресценции в системе, описанной Бючер [32].
Носитель образца - черная поливиниловая камера, в которую помешают
полоску целлогеля лицевой стороной вниз иа целлюлозно-ацетатную мембрану,
пропитанную красителем. Камера закрывается стеклянной пластинкой. Свет с
длиной волны 365 нм от источника-ртутной лампы - проходит через
интерференционный фильтр и через щель направляется сверху на движущуюся
полоску целлогеля. NADPH, образующийся в красителе под действием ФГК-1,
флуоресцирует в УФ свете. Флуоресценция проецируется оптическими линзами
через прерывающий фильтр на фотоумножитель, который направляет лучи на
компьютерный интегратор или самописец. Прибор Sigma FTR-20 снабжен, кроме
того, ртутной лампой, расположенной под образцом, что позволяет
сканировать гели не только в падающем, но и в проходящем свете.
2. Чувствительность. Оказалось возможным определять активность ФГК-1 до
0,1 пмоль/ч.
3. Разрешение и точность. Метод позволяет выявить в смеси двух изозимов
один процент каждого из них. В искусственных смесях двух изозимов
наблюдается хорошее соответствие между пропорциями, предсказанными на
основе спектрофотометрических измерений до смешивания
204
Глава 7
и значениями, полученными в результате измерения флуоресценции после
электрофореза в целлогеле.
Методы описаны ниже (см. также работы [32] и [33]).
3.1. Приготовление образца
С помощью возвратных скрещиваний были получены ин-бредные линии мышей СЗН
и СВА, несущие аллель Pgk-Ia (об их жизнеспособности см. в работе [34]).
В качестве источника аллеля Pgk-Ib можно использовать инбредные или
случайно скрещивающиеся линии.
Выделенные яйца и эмбрионы помещают в микрочашки, как описано в разд.
2.1, но объем поддерживающей среды на микрочашку не должен составлять
более 1 мкл. В качестве такой •среды мы используем РВ1.ПВП (гл. 13, разд.
3.1.3) или буфер для образцов (табл. 7.1).
1. Получите экстракты энзимов замораживанием - оттаиванием клеточных
суспензий, гомогенизированной ткани или образцов в микрочашках (эмбрионов
на стадиях дробления, яиц или различных тканей, отсепарированных у
поздних эмбрионов).
2. Отцентрнфугируйте экстракты при 4°С (5 мин,
1500 об/мин) для осаждения клеточных остатков. Отберите супернатант для
анализа. Если требуется, разбавьте образцы супернатанта.
3. В случае тканевых образцов малого объема (например, отдельных
ооцитов), которые не предназначаются для разбавления, образцы сначала
поместите в 1 мкл РВ1. ПВП в 10 мкл-микрочашки и центрифугируйте в двух
направлениях, как описано в разд. 2.1.
3.2. Электрофорез
Состав различных буферов и красящих растворов, используемых при
электрофорезе, приведен в табл. 7.1.
Буфер для проведения электрофореза и красящие растворы можно хранить до 1
года при 4°С, но буфер для образца надо готовить каждую неделю.
Электрофорез проводится в целлюлозно-ацетатных полосках 5,7X14 см
(Cellogel, Whatman), которые до употребления следует хранить в 30%-ном
метаноле. Для электрофореза используется ватмановский контейнер с опорным
мостиком, на который помещают гель; мостик охлаждается водой при 20°,
циркулирующей через опору из резервуара, снабженного насосом и
термостатом (рис. 7.7).
1. Возьмите полоску целлогеля и осторожно опустите на поверхность
буфера для проведения электрофореза (150 мл которого налиты в пластиковый
сосуд) на
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
205
Таблица 7.1. Приготовление растворов для электрофореза ФГК-1 в целлогеле
Буфер для проведения электрофореза pH 8,6
5,5-диэтилбарбитуровая кислота BDH 4,12 г/л
Цитрат иатрия BDH Analar 2,94 г/л
MgS04-7H20 BDH Analar 1,23 г/л
ЭДТА Sigma 0,74 г/л
1,4-дитиоэритритол Boehringer 25 мг, добавленных непосредственно
перед электрофорезом
АМР Boehringer 45 мг, добавленных в катодный резервуар перед
электрофорезом
Буфер для приготовления образцов
Триэтаиоламии (50 мМ) pH 7,6 Sigma 20 мл
1,4-дитиоэритритол Boehringer 6 мг
Бычий сывороточный альбумин Miles 10 мг
Глицерол Aldrich 20 мл
Красящий раствор А
Триэтаиоламии (100 мМ), pH 7,5 Sigma 14,92 г/л
MgS04-7H20 BDH Analar 4,93 г/л
Красящий раствор Б
Триэтаиоламии (50 мМ), pH 7,6 Sigma 10 мл
К2НР04-ЗН20 BDH 91 мг
