Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 81

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 162 >> Следующая

"I-I 1Т1-1Ч '
0,2 0,4
пМ ГФРТ/биопсия/ч
I I 1 I I I I i т I i гт
0,005 0,01 0,02 0,04
пМ АФРТ/биолсия/ч
• • • •
• м* •
ФФФМ м" •
.issue::.. .
i ii I I 11 i 1 i i-i
10 20 40
Отношение ГФРТ/АФРТ
a
vo
2
10
a
VO
2
e
<
Часы после чХГ
Рис. 7.2. Активность ГФРТ и АФРТ у предимплантационных эмбрионов мыши. А.
Распределение ГФРТ, АФРТ и соотношение ГФРТ: АФРТ в индивидуальных
морулах. В женских морулах активны обе Х-хромосомы, поэтому активность
ГФРТ и соотношение ГФРТ: АФРТ имеет бимодальное распределение в мужских и
женских эмбрионах. У бластоцист Х-хромосома инактивируется в большинстве
клеток женского эмбриона и распределение ГФРТ и ГФРТ: АФРТ становится
унимодальным; соответствующие данные не представлены. Б. ГФРТ, АФРТ и
соотношение ГФРТ: АФРТ в бластомерах, полученных путем биопсии 8-
клеточного эмбриона. В. Повышение активности ГФРТ и АФРТ в процессе
развития предимплантационного мышиного эмбриона. Суперовуляцию самок
получали в соответствии с описанием, данным в гл. 1 (разд. 5.4), сбор
эмбрионов проводили в разные сроки после инъекции чХГ. Первое повышение
активности ГФРТ (до 8-клеточной стадии) определяется материнской мРНК, а
последующее кодируется геномом эмбриона.
198
Глава 7
3. Активность ГФРТ в яйцах от ХО-матерей вдвое ниже, чем активность этого
фермента у яиц от ХХ-матерей (в ходе оогенеза активны обе Х-хромосомы), в
то же время активность АФРТ у таких яиц одинакова.
4. Мэри Харпер [20] использовала тонкослойную хроматографию (ТСХ) для
разделения и количественного определения пуриновых субстратов и
нуклеотидных продуктов и затем сравнивала выход продуктов с тем, что мы
имеем при работе с хлоридом лантана. Было бы неуместно в этой главе
подробно останавливаться на методах ТСХ (см. [29]), достаточно заметить,
что радиоактивность субстрата действительно переходит в радиоактивность
продукта. Использованная система растворителя (60 г сернокислого аммония
в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера при pH 6,8, к которым прибавлены 2 мл п-
пропанола) разделяет субстраты и продукты двойного микроанализа (см. рис.
7.3). Значения активности ГФРТ и АФРТ были получены отдельно в
эмбриональных экстрактах в "единичных" реакционных смесях (см. выше,
разд. 2.6) прн повышении концентрации эмбриональных экстрактов. В
качестве субстрата ГФРТ использовали гуанин. Реакции прекращали
кипячением, изотопы субстрата и продукта разделяли методом ТСХ, выявляли
на бумаге и измеряли их радиоактивность.¦ Субстраты - [3Н]-гуанин и
[14С]-аденин-превращались в продукты [3H]-GMP и [14С]-АМР соответственно
(см. рис. 7.4, А). Для каждой реакции суммарный счет субстрата и продукта
составлял более 90% общего значения, полученного путем хроматографии.
Была сопоставлена оценка продуктов, полученная в результате применения
каждого метода. Радиоактивность пятен [3Н]-GMP и [14С]-АМР сравнивали с
радиоактивностью GMP и АМР, осажденных на стекловолокнистых фильтрах.
Рис. 7.4, Б свидетельствует о том, что процедура осаждения хлоридом
лантана обеспечивает надежное измерение продуктов реакций ГФРТ и АФРТ.
3. Микроанализ ФГК
Бютлер [30] описал разделение электрофоретических вариантов Х-сцепленного
гликолитического фермента ФГК-1 эритроцитов человека путем электрофореза
в крахмальном геле. Соответствующие полосы обнаруживались в результате
обратной реакции превращения 3-фосфоглицерата и АТР в 1,3-дифос-
фоглицерат и ADP (рис. 7.5, А). 1,3 дифосфоглицерат в этом случае
становится субстратом второй реакции, катализируемой глидеральдегид-
фосфат-дегидрогеназой (GAPDH, КФ 1.2.1.12),
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
199
Рис. 7.3. Разделение субстратов и продуктов двойного микрометода
посредством ТСХ. Растворитель помещают в вертикальный хроматографический
резервуар и оставляют на 1 ч для эквилибрации. Образцы по 20 мкл наносят
иа листы бумаги для ТСХ (тонкослойная хроматография) и высушивают.
Разделение проводят при комнатной температуре в направлении, указанном
стрелкой, до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет верхнего края
листа (~4 ч). Лист высушивают. Основания и нуклеотиды определяют
визуально, затем их положение отмечают при коротковолновом УФ свете (254
им). Положение адеиииа, гуанина, АМР и GMP, использованных отдельно или в
виде смеси четырех соединений (смесь), показано в левой части рисунка. В
процессе анализа реакционную смесь с образцом высушивают и разделяют в
воде, содержащей четыре соединения (смесь+образец). Затем определяют
радиоактивность фрагментов каждой дорожки (дорожки обозначены цифрами 1-
7). (Фотография любезно предоставлена Мэри Харпер.)
в ходе которой флуоресцирующий NADH окисляется в нефлуоресцирующий NAD.
ФГК-1 выявляется с помощью длинноволнового УФ-света (365 нм) в виде
темной полосы на флуоресцирующем фоне.
200
Глава 7
Фракция эмбриона
Фракция эмбриона
Иг
24-
12-
я/
Фракция эмбриона
П-I--------1-------------1-
0,12 0,5 1
Фракция эмбриона
Рис. 7.4. Конверсия субстратов в продукты в процессе двойного
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed