Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Whatman-CF/C), пользуясь аппаратом для миллипоровой фильтрации.
Остаточный радиоактивный субст-
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
195
рат удаляется интенсивным промыванием дистиллированной водой.
1. Пронумеруйте стекловолокнистые фильтры, перенесите в стеклянную чашку
Петри (фильтр № 1 сверху) и залейте останавливающей лантановой смесью.
2. Установите аппарат миллипоровой фильтрации. Аппарат помещается на
пластиковый поднос (на случай возможного проливания) вместе с двумя
большими стаканами - один с дистиллированной водой для промывания воронки
после каждой фильтрации, другой с дистиллированной водой и шприцем на 10
мл для промывания фильтров.
3. Поместите первый фильтр на стеклянный держатель, прикрепите над
фильтром воронку и включите миллипоро-вый насос для создания вакуума.
4. Перемешайте содержимое первой пробирки с помощью вортекса и осторожно
налейте первый образец в воронку. Несколько раз тщательно промойте водой
пробирку (общий объем воды 10 мл из 10-миллилитрового шприца) и слейте
все в воронку. Уберите пробирку.
5. Сполосните воронку струей дистиллированной воды (по 10 мл).
6. Возьмите воронку и промойте ее, погрузив сначала в один, а затем в
другой стакан с дистиллированной водой.
7. Промойте фильтр, которым пользовались, следующей порцией воды (10 мл)
и перенесите его на алюминиевую фольгу для просушки.
8. Поставьте на место следующий фильтр, установите воронку и повторите
процедуру фильтрации и отмывки. Продолжайте, пока все образцы не будут
профильтрованы и отмыты.
9. Высушите фильтры в горячем сушильном шкафу.
2.6. Подсчет и графическое изображение результатов
1. Перенесите каждый фильтр в пластиковую виалу и внесите 5 мл
сцинтилляционной жидкости (Liquiflour, New England). Вставьте пластиковые
наконечники и перенесите в завинчивающиеся сцинтилляционные виалы.
2. Измерьте радиоактивность [3Н] и Г14С] в продуктах реакции, содержащих
[3HJ-IMP и ['4С]-АМР, используя двухканальную настройку сцинтилляционного
счетчика, регистрирующую двойную метку.
Когда анализ производится впервые, а также при периодических повторениях
должны срабатывать выбросы счета 3Н, появляющиеся в канале счета |4С, и
наоборот.
196
Глава 7
Эта контрольная процедура делается с использованием реакционных смесей,
содержащих только 3Н (вместо [14С]-аденина берут воду) и только 14С
(вместо [3Н]-гипосантина вносят фосфатный буфер); этот экспериментальный
материал инкубируется, фильтруется и проводится как обычно. С каждой из
этих реакционных смесей ("единичных") сделайте два пустых контроля
(только поддерживающая среда), чтобы вычесть их возможный вклад из
значений счета, полученных для образцов. Для определения эффективности
счета (числа импульсов в минуту/пМ субстрата или продукта) для каждого
изотопа при использованной настройке сцинтилляционного счетчика нанесите
на стекловолокнистые фильтры 5 мкл реакционной смеси с 3Н и реакционной
смеси с 14С. Когда фильтры высохнут, просчитайте их прямо - без осаждения
хлоридом лантана и отмывки.
Чтобы узнать -активность каждого из ферментов при двойном микроанализе,
из общего значения следует вычесть средние для пустых контролей
(представленных полной реакционной смесью и поддерживающей средой), а
также значения счета для образцов, инкубированных в "единичных"
реакционных смесях. Затем число импульсов в минуту для каждого фермента
необходимо перевести в единицы активности (пМ/ч/ /образец) с учетом
рассчитанной выше эффективности счета.
Типичные результаты представлены на рис. 7.2. Рис. 7.2, А демонстрирует
бимодальное распределение (у мужских и женских эмбрионов) активности ГФРТ
и отношения ГФРТ : АФРТ в индивидуальных морулах одного приплода. На рис.
7.2, Б показаны активность фермента и распределения отношения ГФРТ : АФРТ
в бластомерах, полученных в результате биопсии 8-клеточного эмбриона
одного приплода. Значения отношений ГФРТ : АФРТ в биоптатах позволяют
четко идентифицировать мужские и женские эмбрионы [9]. Анализ активности
ГФРТ и АФРТ в ходе предимплантационного развития продемонстрирован на
рис. 7.2, В.
2.7. Оценка двойного микрометода
Поскольку осаждение хлоридом лантана не позволяет прямо идентифицировать
продукты реакции, нельзя исключить возможность утилизации или деградации
субстратов или продуктов другими ферментами. Надежность метода
подтверждается рядом контрольных экспериментов.
1. Устранение ФРПФ исключает счет лантанового преципитата.
2. ГФРТ-отрицательные клетки демонстрируют активность АФРТ (но не ГФРТ).
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
197
А Морулы ГФРТ
VO
5
СО
Т-ГТ1 111
0,5 1
АФРТ
jljs.
" мШфмф
•М ФФФФИФФФФФ
-I-I I I I I 11-----
1 I 1 I-г~т~
2 4
ГФРТ пМ/ч/эмбрион
0,05
т-I-I I I
0,1 0,2 0,4
АФРТ пМ/ч/эмбрион Отношение Г ФРТ/АФРТ
фффффффффффффффф
"I-1 I I I 11 I-------
Т I I 1 Г"
10 20 40
Отношение ГФРТ/АФРТ
Б Биопсированные бластомеры W W ""¦.§_§ • |
"Ф>МФМФ ММ " ФФФФФ ФИ •
I I I I II I
0,05 0,1
