Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
расправить). Поместите на восковое дно препаровальной чашки, покрытое
холодным PBS, и, слегка натянув, приколите ко дну каждый конец булавкой.
2. Вскройте кишечник ножницами вдоль верхней границы мезентерия на длину
2-3 см. Захватите перерезанные концы тонким пинцетом (или кончиком
булавки) ц приколите к воску, осторожно и слегка натянув. Продолжайте
прикалывать через каждые 8-10 мм, пока не приколете полностью. Осторожным
пипетированием удалите с поверхности видимый фекальный материал. Если над
кишкой слой PBS не менее 5 мм, вы меньше рискуете повредить ворсинки.
3. Проведите кратковременную фиксацию 10%-ным формалином в солевом
растворе (30 сек-1 мии) и промойте PBS.
Методы маркирования клеток и их применение
181
4. Полностью закончив препарирование, проведите окончательную фиксацию
формалином в солевом растворе в течение 45 мин при комнатной температуре.
5. Затем инкубируйте в растворе: 20% этанола - 80%
150 мМ трис pH 8,2 с 25 мМ дитиотрейтола в течение 45 мин при комнатной
температуре. Это способствует отделению слизи, которую можно удалить
осторожным пи-петированием под контролем микроскопа. Старайтесь не
повредить ворсинки.
6. Сполосните и перенесите в формол-солевой раствор. Храните до
окрашивания в герметически закрытой посуде.
6.2.2. Окрашивание аблюминальной поверхности кишечного эпителия с
целью демонстрации мозаичных паттернов, образуемых основаниями крипт
Поскольку у взрослой мыши крипты являются моноклональными [44], - каждая
крипта в мозаичном рисунке представляет одну "клетку" [41].
1. Перед разрезанием инкубируйте кишку в 2%-ном (в/о) растворе
гидрохлорида лигнокаина в PBS при 4°С от 30 мин (тонкая кишка) до 1 ч
(толстая кишка).
2. Приколите кишку к восковому дну препаровальной чашки (лучше взять
чашку с черным дном). Начиная с дуоденального конца, пользуясь
препаровальным микроскопом и глазным лезвием, найдите плоскость,
разделяющую мышечные слои и слизистую оболочку. Тонкий прозрачный
мышечный слой можно медленно снять, отводя назад пинцетом, как чулок.
Весь адвентициальный жир или мезентерий нужно предварительно осторожно
удалить; в местах вхождения крупных сосудов и лимфоидных фолликулов
плоскость разреза может быть потеряна, ее нужно восстановить, осторожно
обойдя эти структуры.
3. Закончив, вскройте продольно слизистую оболочку и приколите
ворсинчатой поверхностью (поверхностью просвета) вниз.
4. Фиксируйте формалином в солевом растворе; удалять слизь не надо.
Обработка одной кишки занимает 2-3 ч даже при наличии практики [45].
6.3. Аорта
1. Забейте мышь эфирной анестезией (смещение шейных позвонков может
порвать аорту).
2. Вырежьте аорту от дуги до диафрагмы. Поместите в холодный PBS в
препаровальную чашку с черным воском на дне.
182
Глава 6
3. Осторожно снимите весь жир и прилежащую ткань. Закрепите один конец
булавкой, осторожно вскройте аорту продольно ножницами и приколите.
Осторожно снимите пипеткой прилипший кровяной сгусток.
4. Фиксируйте формалином в солевом растворе или соответствующим
фиксатором.
5. Клеточные границы можно выявить серебряными красителями (0,2%-ный
нитрат серебра; экспозиция на ярком свете), или окрасить ядра гемалумом
для контроля целостности эндотелиального слоя [46].
6.4. Эпидермис
1. Не забудьте до операции сфотографировать мышь, если вы собираетесь
сопоставлять паттерн окраски эпидермиса и покровов.
2. Забейте мышь, очень осторожно выбрейте шерсть электробритвой и
вырежьте нужную площадь кожи. Для приготовления тотального "кожного
препарата", на котором будет изучаться средняя линия, сделайте разрез по
одному боку, вокруг грудной и тазовой областей и отметьте средние линии и
один бок стежком, прежде чем удалить кожу (потом ориентация будет
затруднена, так как кожа потеряет форму).
3. Приколите кожу к деревянной планке и смажьте специальным кремом для
удаления волос, оставьте примерно на 20 мин и сполосните PBS. Пустым
концом резиновой перчатки на пальце осторожно размажьте смесь крема с PBS
по коже - это способствует удалению остаточных волос с минимальным риском
повредить эпидермис. Струей PBS из пластиковой бутыли смывайте крем и
волосы, пока поверхность кожи не будет чистой и гладкой.
4. Уберите булавки и инкубируйте кожу в забуференном солевом растворе
Хенкса с 20 мМ ЭДТА, pH 7,2 при 37 °С в течение 20 ч, слегка взбалтывая.
Это разрыхлит эпидермис.
5. Прикрепите булавками на черное восковое дно чашки эпидермисом вверх и
покройте PBS. Под контролем препаровального микроскопа осторожно отделите
эпидермис, удерживая одним пинцетом дерму и одновременно сложенными
концами второго осторожно отталкивая назад эпидермис. Интактный слой,
соответствующий туловищной области целиком, можно отпрепарировать за 1-2
ч.
6. Перенесите слой (воспользовавшись листом бумаги, стеклянной пластинкой
или просто перелив из одной чашки в другую) в восковую чашку с белым
дном, где его приколите, базальной поверхностью вверх, для окрашивания.
Методы маркирования клеток н их применение
