Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
достаточную вероятность маркирования клеток в раннем эмбриональном
развитии.
4.4. Трансгенные мыши
Трансгенные мыши описаны в гл. 11. Существует принципиальная возможность
введения "маркерных" генов (продукт которых может быть выявлен
гистохимически, иммунологически или гибридизацией in situ) практически на
любой стадии развития - от ооцита до взрослого организма. Для этого
применяют прямую микроинъекцию, инфицирование дефектными ретровирусами
или введение генетически маркированных кле-
176
Глава 6
ток. Насущной проблемой гистохимического или иммунологического выявления
маркера является получение генный конструкций, обеспечивающих стабильную
экспрессию выбранного гена в широком спектре тканей эмбриона и взрослого
организма. Передача маркированного гена по клеткам зародышевой линии в
некоторых случаях может привести к формированию маркированной линии
мышей, а интеграция гена в Х-хромосому обеспечит к тому же и маркер Х-
инактивации.
5. Интерпретация результатов маркирования
5.1, Анализ тканевых экстрактов для выявления мозаичности
В этом случае маркер не дает топографической информации, он лишь
указывает на степень экспрессии генотипа в образце ткани. Укажем
проблемы, которые могут возникать при соответствующем анализе.
5.1.1. Чувствительность
Каковы минимальные размеры минорного компонента ткани, достаточные для
его выявления? Как правило, он составляет 5-10%, хотя для глюкозофосфат-
изомеразы и фосфоглице-раткиназы (гл. 7, разд. 3) продемонстрирована
большая чувствительность. Оценить чувствительность можно с помощью
экспериментов по реконструкции - смешивая тканевые экстракты от каждого
генотипа и определяя активность обоих маркеров.
5.1.2. Специфичность
В настоящее время нет возможности определить, какие типы клеток
представляют какие генотипы в тканевом образце. Вследствие этого при
оценке состава тканевой системы, состоящей из нескольких клеточных типов
(например, .опухоли), моноклональный состав одной клеточной популяции
может быть не распознан из-за примеси других, поликлональных популяций.
5.1.3. Проблеме репрезентативности образцов анализируемой тквни
Существует два аспекта этой проблемы.
1. Различия в составе ткани разных мышей были использованы для
определения числа клеток-предшественников, от
Методы маркирования клеток и их применение
177
которых происходит ткань. Дедукция требует допущения, что клетки-
родоначальницы были выбраны случайно из популяции и каждая из них внесла
свой вклад в клеточный состав анализируемой популяции клеток [6].
Вероятно, ни одно из этих допущений не верно.
2. Исходя из тех же соображений, по количеству клеток каждого типа в
образце химерной ткани судят о размере соответствующего клона в этой
ткани. Такой подход справедлив, если клоны характеризуются одинаковыми
размерами и случайным распределением, однако это совершенно не
соответствует действительности [3].
5.2. Анализ видимых мозаичных паттернов
Использование маркеров, обеспечивающих визуальное определение генотипа
индивидуальных клеток, позволяет обойти многие проблемы, возникающие при
работе с маркерами, не обнаруживаемыми визуально. Но и при этом
интерпретация мозаичных паттернов не так проста, как можно заключить на
основании литературных источников. Ниже приведен краткий перечень
возникающих затруднений, подробности читатель найдет в цитированной
литературе.
5.2.1. Некоторые определения
"Клон" - группа клеток, имеющих общего предка. "Сцепленный клон" - группа
клеток, имеющих общего предка и остающихся пространственно объединенными;
"потомственный клон" ¦- группа клеток, имеющих общего предка, но
разъединенных, так что по пространственному распределению их кластеров
нельзя судить об их общем происхождении. "Бляшка" - это группа
пространственно объединенных клеток сходного генотипа, единица паттерна,
реально наблюдаемая в мозаичной ткани; несколько сцепленных клонов могут
агрегировать, образуя бляшку.
5.2.2. Анализ
1. Измерение размера клона. При этом возникают две проблемы. Первая
связана с агрегацией клонов. Для ее решения предложены различные
математические методы, позволяющие вычислить размер клона по наблюдаемому
размеру бляшки с учетом пропорций клеток каждого генотипа в ткани [40].
Условием применения этих мер является правильная форма клонов, их
одинаковые размеры и случайное распределение [41]. Вторая проблема заклю-
12-171
178
Глава 6
чается в экстраполяции размеров двумерной бляшки из одномерных паттернов,
видимых на гистологических срезах. И в этом случае экстраполяция основана
на недоказанном допущении регулярности или на основании реконструкций по
серийным срезам, что на практике представляет собой слишком утомительное
занятие.
2. Пространственное расположение клонов. В результате изучения
пространственного распределения клонов может быть получена дополнительная
информация. Иногда четкий паттерн выявляется визуально (например, в
пигментном эпителии сетчатки [42] или коре надпочечника [43]). В других
