Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
связывают АДБ-пероксидазу и кажутся черными. Стрелка указывает на
единичную клетку. Расположение некоторых групп клонов выглядит
волнообразным в результате сокращения эндотелия (оно возможно из-за
наличия в стенке аорты эластичных волокон). Детальное обсуждение паттерна
см. в работе [46]. Б. Слизистая тонкой кишки химеры C57BL/6J(B6)
окрашен-
ная АДБ-пероксидазой; вид внутренней поверхности после удаления наружного
мышечного слоя (см. разд. 6). Видны пять бляшек (1) крипт, происходящих
от В6. Поскольку эта химера в значительной степени является
"несбалансированной", компонент В6 оказался в меньшинстве, агрегация
бляшек минимальна и каждая бляшка, вероятно, представлена одним
сцепленным клоном. Сцепленные клоны могут быть частью одного
потомственного клона (обсуждается в работе [3]). Регулярный паттерн фона
образован ворсинками на противоположной стороне пласта, видны также
кровеносные сосуды (2), связывающие АДБ-пероксндазу.
174
Глава 6
4.1. Х-инактивация
Мозаичность по генам, сцепленным с Х-хромосомой, возникает у самок в
результате случайной инактивации в раннем развитии одной из Х-хромосом.
Любой ген, расположенный на Х-хромосоме или оказавшийся там в результате
транслокации, является потенциальным кандидатом на роль маркера. Наиболее
широко используемый маркер при изучении развития мыши- фермент
'фосфоглицерокиназа; полиморфные варианты этого белка выявляются при
электрофорезе. В последнее время для маркирования клонов при изучении
канцерогенеза широко используется полиморфизм длины рестрикционных
фрагментов ДНК (ПДРФ) в сочетании с различиями между активной и
неактивной Х-хромосомами в отношении паттернов метилирования.
Преимущества Х-хромосомного мозаицизма для изучения популяций
маркированных клеток в организме заключается в:
а) отсутствии необходимости создавать химеры,
б) а также в том, что в этом случае нарушения нормального роста и
функционирования ткани минимальны (клеточные популяции мечены только
генами, на которые влияет лишь инактивация Х-хромосомы).
Недостатки системы мозаицизма Х-хромосомы приведены ниже.
1. За исключением пигментированных тканей мышей "flecked" с Х-аутосомной
транслокацией, маркеры Х-инакти-вации визуально не выявляются и,
следовательно, не дают информации о пространственном распределении.
Возможно, вскоре будут разработаны для практического использования при
изучении мышиных и человеческих семенников гистохимические методики, в
основе которых лежит "нулевой" аллель Х-сцепленного фермента глюко-зо-6-
фосфатдегидрогеназы.
2. Х-инактивационные мозаики, как правило, "сбалансированы", что означает
приблизительно равные популяции клеток с активными материнскими или
отцовскими X-хромосомами. Даже при использовании генов Хее,
обусловливающих преимущественную активацию одной Х-хромосомы, популяции
мозаичных клеток образуют пропорцию 70 : 30 (в то время как при химеризме
она составляет 95:5). Это может усложнить анализ клонального состава
мозаичных участков (см. разд. 5).
4.2. Внешние маркеры единичных клеток
Для мечения клеток предимплантационных и ранних пост-имплантационных
эмбрионов используются маркеры, которые
Методы маркирования клеток и их применение
175
можно визуально распознать на гистологических срезах или тотальных
препаратах, - пероксидаза хрена, микросферы латекса, [3Н]-тимидин и
флуорохромы (см. гл. 2 и 3, а также работы [1, 11]). Эти маркеры вводятся
двумя путями: меченные in vitro клетки инъецируют в немеченый эмбрион или
агрегируют с ним, другой путь заключается в прямой инъекции маркера в
отдельные эмбриональные клетки in situ. Маркеры, введенные в отдельную
клетку, наследуются ее потомками, однако при этом происходит разбавление
метки, поэтому метод пригоден только для краткосрочных экспериментов.
4.3. Соматическая мутация
У Drosophila митотическая рекомбинация, индуцированная облучением мух,
гетерозиготных по рецессивной маркерной мутации, иногда дает гомозиготные
мутантные маркированные клетки. Эти клетки продолжают делиться, образуя
клон, узнаваемый по мутантному фенотипу. Ценность методики очень высока
при клональном анализе развития мухи. В принципе, подобную ситуацию можно
смоделировать и у мыши, если у животных, гетерозиготных по маркерному
гену, индуцировать соответствующую мутацию. Именно на этом основан spot-
тест, которым пользуются при анализе потенциальных мутагенов [38].
Мутация "beige", которая в гомозиготном состоянии приводит к образованию
четко аномальных мелаиоцитов сетчатки, тоже может найти подобное
применение [39]. В принципе, на эту роль годится любой выявляемый
визуально маркер, если есть возможность получить его в гомозиготной
форме. При этом могут возникать следующие проблемы:
а) низкая частота и непредсказуемое место маркированных клонов, что
потребует для анализа большого объема ткани;
б) нарушение нормального роста и развития, вызываемое мутагенным
воздействием;
в) необходимость большой популяции клеток-мишеней, обеспечивающей
