Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
не храните их дольше 7 недель. Сосуды Коплина используйте только для G-
окрашивания, после чего просто споласкивайте ее горячей водопроводной
водой. Детергенты, крепкие кислоты и щелочи могут губительно сказаться на
сегментации.
139
Рис. 5.5. А. Кариотип инбредиой мыши C57BL/601a (G-окрашивчние). Полосы
А1, соответствующие С-сегмеитам (стрелка), имеют одинаковые размеры для
каждой гомологичной пары хромосом (особь гомозиготна). Б. Полосы А1
(стрелка) в гомологах 7-й пары хромосом варьируют по длине (особь
гетерозиготна).
Кариотипироваиие гамет, эмбрионов и плодов
141
ного размера, делающим очевидным любой выход из этого ряда. По мере
накопления опыта анализ стандартных микрофотографий позволяет обнаружить
малейшие отклонения.
Стандартная идиограмма насчитывает в мышином кариоти-пе 312 различных
районов, но на одной метафазной пластинке их можно наблюдать крайне
редко. Достоинство принятой номенклатуры [13] заключается в том, что она
оставляет место для последующих данных о сегментной дифференцировке
хромосом, независимо от того, получены ли они в результате
совершенствования техники высокого разрешения деталей или просто из-за
большой проницательности наблюдателя. Некоторая дополнительная информация
уже получена, но, к сожалению, техника высокого разрешения, предложенная
для человеческих хромосом, практически ничего не дала для анализа
хромосом мыши. Только в самое последнее время появилась публикация
идиограммы более высокого разрешения [14]. В настоящее время стандартной
считается идиограмма, принятая в 1974 г., но на ближайшее будущее
планируется легализация ее последней версии.
G-окрашенный препарат находит применение во многих случаях, например для
выявления отсутствующих, добавочных или аберрантных хромосом, для
выявления сбалансированных и несбалансированных хромосомных сегментов
после мейотической сегрегации, для картирования локусов на хромосоме
после гибридизации in situ [5, 6] или традиционного диетического анализа
с использованием маркерных генов, точек разрыва и транслокацин. При
описании аномальных кариотипов необходимо следовать правилам
рекомендуемой номенклатуры [15].
Наиболее существенная вариация, обнаруженная в G-окрашенном кариотипе
различных мышиных линий, - разное количество материала А1-сегмента
(районы, являющиеся синонимами С-сегментов), наблюдаемое в некоторых
хромосомах. Размер Al-сегмента часто служит линейным маркером, а различия
по этому признаку могут быть использованы, в частности, для выявления
генетического вклада [16]. Некоторые различия в А1-сегменте иллюстрирует
рис. 5.5,5.
5.4. Окрашивание неактивной Х-хромосомы
Если перед исследователем стоит задача убедиться в активности или,-
наоборот, в отсутствии активности отцовской или материнской Х-хромосомы в
клетках фетального происхождения, прежде всего следует
обеспечитьидентификациюэтих хромосом. В качестве удобных маркеров можно
рекомендовать X - ауто-сомные реципрокные транслокации наподобие Т
(Х;4)37Н или X - аутосомные инсерции Is (In7; X) ICt, причем в обоих
142
Глава 5
Таблица 5.7. Окрашивание для выявления неактивной Х-хромосомы
1. Приготовьте клеточную суспензию плода в среде, как было описано в
табл. 5.3, А Отцентрифугнруйте суспензию прн 200 g в течение 5 мин п
отбросьте супернатант.
2. Ресуспендируйте клеточный сгусток в 0,56%-ном водном растворе
хлористого калия при 50 °С не более 30 мин. Длительное гипотоническое
воздействие при этой температуре серьезно нарушает морфологию хромосом,
поэтому следует стараться сократить время воздействия, чтобы получить
адекватную дифференцировку и не допустить нарушений.
3. Центрифугируйте при 200 g в течение 5 мин, фиксируйте и делайте
препараты, как описано в табл. 5.3,5.
4. Окрашивайте стекла 2-5%-ным раствором Гимза в буфере pH 6,8 (таблетки
Gurr). Просматривайте мокрые стекла при Х128, появление темного
окрашивания Х-хромосомы должно быть видно.
5. Если окраска удачна, сполосните стекло в буфере pH 6,8, высушите
струей воздуха.
6. Анализируйте препарат либо сразу с иммерсией, либо сделайте постоянный
препарат, заключив в DePex или Eukitt и закрыв покровным стеклом.
случаях речь идет о маркерной хромосоме, превосходящей по длине самую
большую нормальную хромосому мыши (см. в работе [17] список таких
маркеров). Еще одно требование заключается в том, что неактивную Х-
хромосому нужно уметь отличить от активной. Существует ряд
соответствующих методик, включающих радиоавтографию и системы замещения
5-бром-дезоксиуридином (БУДР). Мы приведем, по нашему мнению, более
простой метод Канда [18] (табл. 5.7). Он не требует сложного оборудования
и большой затраты времени.
К сожалению, метод Канда не лишен недостатков: многие митотические клетки
оказываются поврежденными, однако оставшихся интактными вполне
достаточно, чтобы выявить активную Х-хромосому. На рис. 5.6, Л изображена
митотическая клетка, у которой нормальная Х-хромосома неактивна. Она
