Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 49

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 162 >> Следующая

46. Chandley A. C" Goetz P., Hargreave Т. B., Joseph A. М., Speed R. M.
(1984). Cytogenet. Cell Genet., 38, 241.
47. Speed R. M. (1982). Chromosoma, 85, 427.
48. Speed R. М., Chandley A. C. (1983). Chromosoma, 88, 184.
49. Speed R. M. (1984). Hum. Genet., 66, 176.
50. Speed R. M. (1986). Chromosoma, 94, 115.
ГЛАВА 5
КАРИОТИПИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА ГАМЕТ, ЭМБРИОНОВ И ПЛОДОВ;
ГИБРИДИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ
,Е. П. Эванс1
1. Введение
Важность применения цитогенетических методов для изучения развития
млекопитающих не вызывает сомнения. Эти методы совершенно незаменимы в
тех случаях, когда перед исследователем стоят задачи идентификации
хромосом анеуплоидных зигот, определения пола эмбрионов, выявления
инактивированной Х-хромосомы, анализа химеризма. Необходимы они и при
картировании природных и введенных путем гибридизации генов, и при
изучении структуры хроматина. Для цитогенетического анализа иногда бывает
достаточно всего лишь нескольких клеток, что очень важно в тех условиях,
когда биологический материал ограничен.
Эмбриогенез млекопитающих служит важнейшим источником митотически
делящихся клеток. Однако число качественных метафазных пластинок
определяется возможностями современной техники приготовления препаратов
хромосом. Цель этой главы - описать некоторые методические приемы и пути
использования препаратов, полученных с их помощью, для решения
разнообразных задач -от простого определения числа хромосом до
гибридизации in situ и выявления сегментной диффе-ренцировки хромосом.
Большинство методик, о которых будет идти речь, разработано для мыши,
однако многие из них могут быть использованы и для экспериментирования на
других млекопитающих, включая человека.
2. Основные методы
Одно из главных условий успешного цитогенетического анализа митотических
клеток заключается в получении хорошо расправленной метафазной пластинки,
в которой хромосомы не накладывались бы одна на другую. Для этого
существует четыре методических приема:
а) обработка клеток соединениями, останавливающими митоз;
1 Е. P. Evans. William Dunn School of Pathology, South Parks Road, Oxford
OXI 3RE, UK.
126
Глава 5
б) воздействие гипотоническим раствором, вызывающее разбухание клеток;
в) фиксация, сохраняющая морфологию хромосом;
г) распластывание и уплощение клеток на предметных стеклах.
Какой именно из этих четырех приемов следует применить в каждом
конкретном случае, зависит от исследуемой стадии эмбриогенеза. В
некоторых случаях полученные препараты подвергаются дальнейшей обработке.
Такие ситуации будут также описаны ниже.
3. Оборудование
Оборудование, необходимое для получения целых пред- или
постимплантационных эмбрионов или их фрагментов, описано в гл. 2 и 3. Оно
может быть использовано для получения образцов материала и приготовления
препаратов хромосом, причем в этом случае требования к оборудованию
гораздо меиее жесткие. Для цитогенетических целей подойдет любой
препаровальный микроскоп с падающим и проходящим светом, с хорошим
рабочим расстоянием и оптическим увеличением до Х50. Более того, образцы
можно брать достаточно тонкими, вытянутыми вручную микропипетками.
Поскольку этап культивирования клеток очень краток, он не требует
усложненной культуральной среды с сывороткой и газом. Следует по
возможности избегать силиконирования оборудования, так как любой контакт
с силиконом может значительно затруднять распластывание митотических
клеток.
Для получения и осаждения клеточных суспензий желательно иметь центрифугу
с плавным ускорением/замедлением, обеспечивающую 200 g. Поскольку,
согласно протоколам, обработка препаратов производится при разных
температурах, необходимо иметь в распоряжении достаточное количество
водяных бань и печей, в которых поддерживается нужная температура. Анализ
хромосом, особенно если они дифференциально окрашены и несут зерна
серебра, требует хорошего микроскопа. В идеальном случае он должен иметь
фазово-контрастное устройство для работы с неокрашенными препаратами,
объективы Х16 и Х100 хорошего качества и фотонасадку 35 мм. Он должен
быть настроен таким образом, чтобы всегда мог дать максимальное
разрешение. Необходим набор фильтров для анализа и фотографирования
окрашенных хромосом; интерференционные фильтры, такие, как Balzer № 8,
улучшают изображение и увеличивают контраст. Для фотографирования
хромосом нужен набор 35-мм пленок. Каждая пленка имеет свои
характеристики. Наиболее широко применяются техническая пленка
Кариотипирование гамет, эмбрионов и плодов
127-
Kodak Pan 2415 и проявитель Kodak НС110. Время проявления указано в
руководстве к заводскому раствору Д.
Все стекла, используемые для приготовления препаратов-хромосом, должны
быть чистыми. Хотя процесс очистки является обязательным этапом при
изготовлении стекол, их нельзя считать абсолютно чистыми. Об этом
свидетельствуют интерференционные кольца, которые видны между сложенными
стеклами, когда они извлечены из упаковки. Их следует оставить на ночь в
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed