Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 47

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 162 >> Следующая

клеток можно видеть невооруженным глазом.
5. Дайте клеткам распластаться по поверхности в течение 30 сек, затем
соберите их, прикоснувшись к поверхности раствора стеклом, покрытым
пластиком.
6. Оставьте стекло в горизонтальном положении на 10 мин, чтобы больше
клеток осело, затем фиксируйте параформальдегидом.
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
119
7. Спустя 5-10 мин промокните излишки фиксатора и промойте стекла в
течение 30 сек в 0,4%-ном Photoflo.
8. Дайте стеклам высохнуть в горизонтальном положении при комнатной
температуре.
4.2.3. Окрашиввние
Наиболее удобный способ окраски - быстрый метод окрашивания коллоидным
серебром Хаувелла и Блэка [43], первоначально предложенный для
окрашивания ЯОР. Требуется два раствора.
1. Приготовьте коллоидный проявитель, растворив 2 г порошкообразной
желатины в 100 мл деионизированной воды и 1 мл чистой муравьиной кислоты.
Помешивайте в течение 10 мин, чтобы растворить желатину. Раствор стабилен
в течение 2 недель.
2. Приготовьте водный раствор нитрата серебра (4 г AgNCb в 8 мл
деионизированной воды). Этот раствор стабилен. Храните коллоидный
проявитель и раствор серебра в закрытых флаконах из коричневого стекла.
3. Нанесите пипеткой две капли коллоидного проявителя и четыре капли
водного нитрата серебра на предметное стекло с распластанными клетками.
Смешайте растворы и закройте покровным стеклом.
4. Поместите предметное стекло на поверхность нагревательного столика для
высушивания препаратов, отрегулированного на 70°С.
5. В течение 30 сек красящая серебром смесь пожелтеет, а через 2 мин
станет золотисто-коричневой. Возьмите препарат, снимите покровное стекло
и смойте красящую смесь деионизированной водой.
6. Промокните препарат досуха и исследуйте немедленно под микроскопом.
Ш. Приготовление сеток для электронной микроскопии
1. Найдите качественно окрашенные серебром клетки под малым увеличением
(Х25) светового микроскопа. Вокруг клеток, пригодных для электронно-
микроскопического анализа, проведите черту на пластиковом покрытии,
воспользовавшись для этого лейцевским алмазным карандашом.
2. Когда все нужные клетки будут локализованы, перенесите круглые диски
пластика, вырезанные алмазным карандашом, на поверхность дистиллированной
воды в большой квадратной стеклянной чашке для окрашивания. Это
достигается медленным погружением наклоненного под уг-
120
Глава 4
Рис. 4.8. Сперматоциты иа стадии диплотены. Препарат получен путем
поверхностного распластывания н окрашивания серебром. А. Мышь (CM). X и Y
хромосомы лежат раздельно (стрелка). Б. Человек (ЭМ).
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
121
лом стекла в воду, при этом поверхностное натяжение воды снимет
пластиковые диски со стекла.
3. Соберите диски один за другим следующим образом. При помощи
часового пинцета осторожно подведите ЭМ сетки [G 200 HS Си (Gilder)] под
пластиковые диски. Осторожно поместите диск на поверхность сетки,
воспользовавшись для этого упругим волоском, прикрепленным к концу тонкой
деревянной палочки. Извлеките сетки с дисками из воды. Дайте сеткам
просохнуть, затем изучайте в ЭМ.
На рис. 4.8, Л показаны распластанные диплотенные сперма-тоциты мышн,
полученные описанным выше способом, а на рис. 4.8, ? - сперматоциты
человека. На рис. 4.8, Л препарат сфотографирован в СМ, на рис. 4.8,5 - в
ЭМ. Следует заметить, что ни центромеры, ни центральный элемент СК на
препаратах, окрашенных серебром, не различимы. Для выявления этих
структур их следует окрасить ФВК (разд. 4.1).
Результаты применения этой методики в нашей лаборатории для изучения
сперматоцитов у человека, гетерозиготного по транслокацин [44],
нескольких инверсионных гетерозигот у мышн [45] и для изучения спаривания
X-Y хромосом у мужчины [46], можно найти в литературе. Распластывание
широко используется для анализа профазы мейоза у самцов. Эта методика
действительно открывает новые перспективы исследования мейоза.
4.3. Распластывание ооцитов
Материал (мышиные или человеческие яичники) должен быть как можно более
свежим. Через 24 ч морфология пахнтен-ных клеток будет в большой степени
искажена. У человека фетальные яичники содержат максимальное число
пахитен примерно в возрасте 26 недель, хотя появляются они на 14-й неделе
и могут быть обнаружены уже на 30-й неделе беременности. У мыши
максимальное число пахитен выявляется около 18-го дня после спаривания,
хотя этот срок может варьировать в зависимости от ЛИНИН.
Простой способ распластывания ооцитов, впервые предложенный Спидом [47],
заключается в следующем.
1. Поместите яичники в PBS. Кусочки яичннка человека измельчите
скальпелем на фрагменты около 2 мм (у мыши для приготовления одного
стекла используется весь яичник).
2. Поместите один кусочек ткани яичника (илн целый яичник, если это мышь)
на чистое предметное стекло в 2-3 капли 0,2 М (4,5%) сахарозы
(приготовленной на дистиллированной воде).
122
Глава 4
Рис. 4.9. Ооциты на стадии пахитены. Препарат получен путем распластыва
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed