Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 45

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 162 >> Следующая

недавно появилось сообщение о том, как извлекать яйцеклетки для
оплодотворения in vitro после применения чХГ [35].
Следует заметить, что ни одному из исследователей не удалось получить
препараты яйцеклеток человека в MI такого ка-
8-171
Глава 4
' PF . . '
sB
Рис. 4.7. С-окрашенный препарат стадии МП самки мыши,
чества, чтобы можно было надежно подсчитать хиазмы. Другие виды
млекопитающих в этом отношении не представляют серьезной проблемы, и
совершенно неприятно, почему эта задача с таким трудом решается на
человеческом материале.
4. Микрораспластывание для профазного анализа
4.1. Поверхностное распластывание для электронно-микроскопического
анализа сперматоцитов
Разработка простого и быстрого метода поверхностного мик-рораспластывания
для выявления синаптонемного комплекса в профазе мейоза сперматоцитов
насекомых [36] революционизировала наши представления о поведении
хромосом в процессе этой важной стадии мейоза. Применение этой методики к
сперматоцитам млекопитающих [37-39] продемонстрировало ее возможности как
для анализа аномалий в поведении хромосом в профазе мейоза, так и для
анализа нормального мейоза. В современной цитогенетической литературе
накопилось множество данных по "распластыванию", охватывающих все виды
эукариот от растений до человека.
Распластанные препараты синаптонемного комплекса (СК.) получены благодаря
использованию поверхностного натяжения
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
115
водного раствора. СК, к которому прикрепляются хроматино-вые фибриллы,
впервые появляется перед или во время синапса и исчезает при или после
расхождения хромосом. Появление признаков спаривания в СК точно отражает
поведение конъюгирующих мейотических хромосом в течение профазы. Техника
распластывания не годится для клеток, вступивших в метафазу. Существует
большое разнообразие способов распластывания и, конечно, было бы
невозможно представить здесь точные детали каждого из них. Тем не менее
можно дать некоторые общие рекомендации.
Существуют два принципиальных метода, два уровня наблюдений-
светооптический (СМ) и электронно-микроскопический (ЭМ). Первый
подразумевает сбор распластанных клеток с поверхности раствора соли или
сахарозы на стекло и обычно используется для распластывания
сперматоцитов, в достаточном количестве имеющихся в суспензии. Второй
включает осаждение клеток на поверхность стекла через раствор сахарозы,,
соли или другого вещества и применяется главным образом для ооцитов, но
может быть использован и в случае суспензии сперматоцитов.
Методика поверхностного распластывания сперматоцитов-впервые была
предложена Мозесом [37], она основана на способе Каунса и Мейера [36].
1. Поместите семенники или биоптат тестикул в минимальную среду Игла
(Gibco Biocult, MEM без глутамина), осторожно мацерируйте канальцы
закругленным тупым: пинцетом. Втяните клеточную суспензию в шприц 1-мил-
лилитровой иглы. Опустите шприц, чтобы крупные фрагменты ткани осели,
подержите так в течение минуты. Вылейте их и отбросьте. Оставшуюся чистую
суспензию несколько раз вылейте и втяните в шприц, чтобы разрушить комки
клеток.
2. Снова доведите объем жидкости до 1 мл, добавив МЕМ, вылейте в
коническую стеклянную центрифужную пробирку и центрифугируйте 5 мин при
150g при комнатной температуре.
3. Супернатант отбросьте, оставив объем, примерно вдвое превышающий объем
сгустка. Ресуспендируйте сгусток. Держите суспензию на льду.
4. Осторожно возьмите микропипеткой каплю суспензии и прикоснитесь ею к
поверхности распластывающего раствора. Последний состоит из
профильтрованного 0,5%-ного раствора NaCl в черной эмбриологической
препаровальной чашке. Прежде чем внести клеточную суспензию, протрите
поверхность оптической или неворсистой туалетной бумагой, отрегулируйте
уровень жид-
'116
Глава 4
кости так, чтобы ее поверхность была слегка выпуклой. После нанесения
клеток дайте поверхности стабилизироваться в течение 1-2 мин.
5. Подготовьте медные сетки (Pelco: GC-100) следующим образом. Нанесите
на них пленку 0,3%-ного формвара, затем напылите углем. Перед
использованием сделайте сетки гидрофильными путем ионизации их слабым
разрядом (2 мин, 1,3 кВ, 0,1 Тогг). Пинцет для захвата сеток должен быть
абсолютно чистым, после каждой манипуляции его нужно очищать, прокалывая
концами ватманскую фильтровальную бумагу № 1.
6. Прикоснитесь сетками (каждой не более одного раза) к разным районам
поверхности, несущей клетки. Используйте примерно 10 сеток.
7. Фиксация. Фиксатором служит 10%-ный параформальдегид в 0,1 М растворе
сахарозы; нагрейте до 60-80 °С с шестью каплями NaOH, помешивая, пока
раствор не станет прозрачным. При помощи боратного буфера с pH 9 доведите
pH до 8,5. Профильтруйте и храните при 4 °С не дольше 1 недели.
8. Быстро опустите сетки на чистую поверхность фиксатора в маленькой
чашке (по 5 сеток на чашку), прикройте крышкой и оставьте по меньшей мере
на 5 мин (но не больше 10 мин). Можно поступить иначе: распределите 10
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed