Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 43

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 162 >> Следующая

9-й хромосоме человека "парамеры" - тельца, различимые только на пахитен-
ной стадии [10, 14, 15]. Они соответствуют С-положительным районам данной
хромосомы, видимым в метафазе.
2.7. Использование высушенных на воздухе мужских мейотических препаратов
для молекулярных анализов
Препараты пахитенных хромосом, приготовленные способом, описанным в разд.
2.6, были использованы для локализации генов при гибридизации in situ
[16, 17]. Сделан вывод, что разрешение, полученное в результате
применения этого метода, значительно выше, чем в хромосомах соматических
клеток даже
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
109
при использовании высокоэффективного окрашивания [16, 17].
Локализовать последовательности в 9-й хромосоме человека in situ удалось
на высушенных метафазах MI и MII, приготовленных по прописи,
рекомендуемой в разд. 2.2 [15]. На рис. 4.5 показана последовательность
Xbi вторичной перетяжки 9-й хромосомы. Детали процедуры гибридизации in
situ можно узнать из оригинального источника, а также из разд. 6 гл. 5
данного руководства.
Недавно на мейотических клетках человека [18] и мыши [19, 20] были
выполнены эксперименты с ник-трансляцией in situ в сочетании с
радиоавтографией после воздушного высушивания. В этих экспериментах
препараты хромосом обрабатывали на стекле ДНКазой I, ДНК-полимеразой I и
радиоактивными дезоксирибонуклеотидами. Районы хромосом, особенно
чувствительные к нуклеазной атаке (с более открытой конформацией
хроматина), могут быть выявлены по распределению зерен серебра на
радиоавтографических препаратах. Детали этой методики (аналогичной той,
что была предложена Керемом для соматических хромосом [21]) читатель
найдет в оригинальных статьях.
3. Приготовление препаратов женских мейотических хромосом высушиванием
на воздухе
3.1. Профаза мейоза
Первое мейотическое деление у самки начинается в эмбриогенезе и ооциты на
стадии профазы вплоть до диплотены обнаруживаются лишь в яичнике плода.
Примерно ко времени рождения ооциты вступают в стадию покоя (диплотена
или диктио-тена), которая заканчивается незадолго до овуляции. Ранние
цитогенетические исследования профазы мейоза в оогенезе при помощи
методик воздушного высушивания включают работы Рерборна и Хэнсмана на
мышах [22] и на человеке Лучиани и Сталь [23], Курило [24].
У мыши профаза мейоза приходится на 13-й день беременности*
максимальнее'число пахитен наблюдается до'сле 16- 18 дня. У женщины мейоз
начинается к концу первого триместра и далее, по мере развития
беременности, все больше и больше клеток вступает в профазные стадии
лептотены, зиготены и пахитены. Изучение яичников абортированных
человеческих плодов показало, что клетки на стадии пахитены
обнаруживаются с 16-й по 23-ю нед. беременности [25].
В последние годы техника приготовления препаратов фетальных ооцитов
человека и мыши благодаря методике микрорас-
до
Глава 4
-' С.
¦* . <
Рис. 4.5. Гибридизации in situ с зондом последовательности Xbi хромосомы
9 человека. Бивалент 9 отмечен стрелкой. (Из работы [15], воспроизводится
с разрешения )
пластывания намного продвинулась, качество препаратов стало превосходным,
возросла их разрешающая способность, поэтому все дискуссии о
целесообразности изучения хромосом в оогене-зе на стадии профазы мейоза
могут быть отставлены (разд. 4.3).
3.2. Препараты ооцитов Ml и МП, полученные при культивировании in vitro
Ооциты в MI получают при помощи культивирования in vitro со стадии
блокированной диктиотены зародышевого пузырька. Эта методика впервые была
применена Пинкусом и Энцма-ном [26] на ооцитах кролика. Продолжение
мейоза было стимулировано высвобождением ооцита из фолликула [27].
Наиболее ранняя публикация, посвященная методике культивирования мышиных
и человеческих ооцитов, принадлежит Эдвардсу [28]. При успешном
культивировании удается получить ооциты на стадии МИ; альтернативный
способ заключается в сборе све-жеовулированных ооцитов из фаллопиевых
труб; соответствующая процедура описана в разд. 3.3.
В нашей лаборатории препарирование яиц мыши, созревших in vitro, с
успехом производится по методу Спида [29].
W
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
111
Рис. 4.6. Ооцит мыши, выделенный из фолликула, стрелкой отмечен его
зародышевый пузырек (А); после культивирования до MI (Б). (Из работы
[29], воспроизводится с разрешения.)
1. Вырежьте яичники и поместите их в физиологический раствор (0,9%).
Воспользовавшись препаровальным микроскопом, проколите крупные фолликулы
стерильным скальпелем.
2. Яйца с четко видимым зародышевым пузырьком (ЗП) (рис. 4.6,Л)
перенесите стерильной пипеткой в культуральную среду. В качестве среды
используется эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС 9,5 мл) и триптозофос-
фатный бульон (Oxoid, 0,5 мл), содержащий 0,25 мМ пирувата натрия, 1,0 мМ
глутамина и 5,56 мМ глюкозы.
3. Удалите приставшие к яйцу фолликулярные клетки, пипе-тируя
микропипеткой с узким отверстием.
4. Поместите 20-40 яиц в 1 мл среды в центральную лунку чашки 60X15 мм
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed