Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
возрасте при лечении рака предстательной железы или при изучении
бесплодия молодых мужчин.
Мейоз начинается у самцов в период их полового созревания. Он
представляет собой интегральную часть сперматогенеза- процесса,
начинающегося серией митотических делений сперматогониев. После
предмейотической Siфaзы клетки уже в качестве сперматоцитов вступают в
длительную профазу мейоза и затем претерпевают два деления, ведущих к
образованию гаплоидных гамет. На препарате высушенной на воздухе
суспензии клеток из семенников половозрелого самца с нормальной
способностью к оплодотворению можно различить три типа
1 А. С. Chandley M.R.C, Clinical and Population Genetic Unit, Western
General Hospital. Greve Road, Edinburgh EH4 2XU, UK.
7*
100
Глава 4
делящихся клеток: сперматогониальные метафазы и метафазы I и И делений
мейоза. В случае бесплодия сперматогенез подавлен или блокирован, о чем
свидетельствует полное отсутствие или недостаток на препаратах клеток,
находящихся на поздних стадиях сперматогенеза.
Метафаза I (MI)-стадия мейоза, обычно используемая для определения числа
бивалентов, частоты и положения хиазм и установления хромосомных
аномалий, таких, как реципрок-ные транслокации, имеющие конфигурацию
мультивалентов. На стадии MI у человека X и Y хромосомы соединены коиец-
в-конец двумя короткими плечами (р), а у мыши - двумя длинными (q). У
небольшой части клеток обоих видов половые хромосомы в MI лежат
раздельно, высокая частота встречаемости таких клеток указывает на
стерильность особи. Клетки, находящиеся во втором делении мейоза (МП),
анализируются с трудом из-еа того, что плечи хромосом сдвигаются и
перекрывают друг друга, но после распластывания они могут и в
действительности используются для выявления анеуплоидов, возникающих в
результате ошибок при расхождении хромосом во время первого мейотического
деления [1, 2J.
Методика воздушного высушивания, обычно используемая для приготовления
препаратов мейотических хромосом человека и мыши, принадлежит Ивансу
[3J!). Этот способ в том виде, как он был впервые описан, применяется для
анализа мейоза у мышей (разд. 2.1). Для материала человеческих семенников
этот метод модифицирован в нашей лаборатории (разд. 2.2).
2.1. Метод суховоздушных препаратов для мышей
1. Извлеките семенники из белочной оболочки (tunica albuginea) и
поместите их в изотонический раствор цитрата натрия (2,2% в/о) при
комнатной температуре.
2. Перенесите семенники в свежий 2,2%-ный раствор цитрата натрия в
маленькой чашке Петри и осторожно вытяни-' те канальцы. Придерживая массу
канальцев тонким прямым пинцетом, осторожно выдавливайте их содержимое
другим, тонким закругленным пинцетом. Когда канальцы станут плоскими и
матовыми, оставьте их и осторожно перенесите надосадочную жидкость в 15-
мл центрифужную пробирку.
3. Отцентрифугируйте полученную клеточную суспензию 5 мнн при 50 g. При
этом большинство спермиев останется в суспензии, а в осадке будут клетки
большего разме-
1 Аналогичный метод несколько ранее предложен А. П. Дыбаном (Цитология,
1979 т.). - Прим. ред.
Анализ мейоза в половых клетках человека и мыши
101
ра, включая сперматоциты. Удалите супернатант, а осевшие клетки
ресуспендируйте приблизительно в 3 мл 1%-ного раствора цитрата натрия.
4. Оставьте клетки в гипотоническом растворе на 12 мин при комнатной
температуре. Отцентрифугируйте при 50 g в течение 5 мин с медленным
ускорением.
5. Удалите как можно больше супернатанта. Встряхните осадок так, чтобы
слой суспензии прилип к стенкам пробирки. Быстро прибавьте к суспензии
клеток 0,25 мл фиксатора метанол: ледяная уксусная кислота (3:1).
Тщательно перемешайте пастеровской пипеткой. Добавьте еще фиксатора по
стенке, продолжая перемешивать, пока пробирка не наполнится примерно на
треть. Через 5 мин осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте в
свежем фиксаторе. Спустя 10 мин снова смените фиксатор, контролируя вид
суспензии; она должна быть слегка мутной.
6. Сделайте пробный препарат, нанеся каплю суспензии на обезжиренное
(вымытое кислотой со спиртом) предметное стекло при комнатной
температуре. Если стекло тща-' тельно очищено и фиксация
удовлетворительна, капля равномерно растечется; осторожно подув на
стекло, можно ускорить высыхание капли. Изучайте при помощи фазового
контраста. Если клеточная суспензия слишком разведена, отцентрифугируйте
снова и добавьте меньший объем фиксатора, если слишком густая - больше
фиксатора.
2.2. Модификация методики при работе с человеческим материалом
1. Соберите материал тестикулярной биопсии в гипотонический раствор 1%-
ного цитрата натрия.
2. Спустя 30 мин очень мелко нарежьте семенные канальцы ножницами в чашке
Петри, слегка покачивая ее, чтобы крупные куски канальцев осели на дно.
Отсосите клеточную суспензию пипеткой и отцентрифугируйте при 450 g (судя
по нашему опыту, чем тоньше суспензия, тем лучше фиксируются препараты).
3. Удалите большую часть надосадочной жидкости, так чтобы оставшаяся едва
