Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
¦6. Сперматозоиды, приготовленные этим способом, могут быть использованы
прямо, в капле для оплодотворения, или отмыты путем добавления 10- 15 мл
фертилизационной среды (среды для оплодотворения) и центрифугирования.
морфологией. Процент морфологически нормальных спермиев изменяется
незначительно. Применение этой техники снижает и бактериальное
загрязнение образца [21].
7. Оплодотворение и культивирование эмбрионов
7.1. Осеменение
Ооцит, извлеченный из фолликулярного аспирата, переносят в 1 мл среды для
оплодотворения (табл. 14.3) под масло. Степень зрелости ооцита
определяется по объему кумулюсной массы (см. рис. 14.3) или, после
удаления кумулюса гиалурони-дазой, по наличию или отсутствию зародышевого
пузырька или полярного тельца (разд. 5). Ооциты выдерживают в инку-
¦баторе с 5% СО? при 37 °С в течение 4-5 ч. К капле, содержащей
яйцеклетку, добавляют кончиком стерильной микропипетки аликвоту,
содержащую 100 000 подвижных спермиев, при-
25*
380
Глава 14
готовленных методом флотации или разделением в перколле. Чашку возвращают
в инкубатор, спустя 14-16 ч яйца извлекают и определяют, произошло ли
оплодотворение.
7.2. Доказательство оплодотворения
Клетки кумулюса удаляются с поверхности блестящей оболочки осторожным
пипетированием стеклянной пастеровской пипеткой, оттянутой таким образом,
чтобы диаметр ее кончика был чуть больше яйца, или путем отделения
вручную с помощью инъекционных игл (27 калибра). Учитывается наличие и
число пронуклеусов. Если оплодотворение произошло, через 14-20 ч после
осеменения в ооплазме должны быть видны два пронуклеуса (рис. 14.3,В).
Трехъядерные яйца (рис. 14.3,Г) отбрасывают ввиду потенциального риска
беременности с пузырным заносом [32].
7.3. Культивирование оплодотворенных яиц
Ооциты с двумя пронуклеусами переносят в капли культуральной среды
объемом 50-100 мкл (табл. 14.3) под маслом и инкубируют в течение ночи с
5% СОг в воздухе. Если развитие идет нормально, прохождения второй
борозды дробления и 2-клеточной стадии (рис. 14,3, Д) следует ожидать
между 28 и 36 ч после осеменения, 4-клеточная стадия (рис. 14.3, Е)
наступает между 32 и 48 ч. Оплодотворение in vitro предполагает перенос
эмбрионов в матку на этой стадии (табл. 14.9), поэтому временные
характеристики последующих стадий дробления человеческих
предимплантационных эмбрионов изучены хуже.
7.4. Развитие до стадии бластоцисты
Время удвоения числа клеток для индивидуальных эмбрионов подвержено
большим колебаниям (8,1-51,0 ч [33]) со средним значением в пределах
между 18 и 23 ч в зависимости от возраста пациентки и использованного
режима стимуляции. Возможно, эти вариации отражают качественные
особенности индивидуальных эмбрионов, так как понятно, что быстрее
делящиеся эмбрионы с большей вероятностью дадут начало беременности после
переноса в матку [34]. Развитие человеческих эмбрионов до стадии поздней
бластоцисты (рис. 14.3,3) происходит примерно у трети оплодотворенных яиц
[19, 35]. Большинство прекращает развитие на 4-клеточной стадии, однако
при этом следует помнить, что речь идет о "лишних" с точки зрения
терапевтических требований эмбрионах, поскольку "мор-
Оплодотворение ооцитов человека
381
Таблица 14.9. Лабораторная процедура переноса эмбрионов (техника "не-
касания")
1. Приготовьте примерно 20 мл среды для переноса, забуференной HEPES,
содержащей 10% сыворотки материнской крови, и нагрейте до 37 ;С.
2. Приготовьте крупную каплю среды для перемещения, забуференной HEPES,
под маслом и нагрейте в инкубаторе на воздухе (не ССЕ). Для этого в
пластиковую чашку Петрн (Falcon 3002) поместите около 500 мкл среды и
наслоите сверху около 8 мл масла. Затем добавьте еше 750- 1000 мкл среды,
чтобы образовалась "крупная капля", облегчающая всасывание в катетер для
переноса.
3. Тем временем пациентку укладывают в "положение для камнесечения" со
слегка запрокинутой головой (или в положение колени к груди). Шейку матки
экспонируют с помощью двустворчатого влагалищного зеркала и осторожно
очищают от слизи тампоном, пропитанным средой для переноса. Затем шейку
матки орошают из шприца с иглой еще 3-5 мл среды. Избыток среды стекает к
заднему своду влагалища и забуферива-ет продукты его секреции.
4. Когда пациентка подготовлена для процедуры имплантации, на
нагревательный столик стереомикроскопа поместите чашку с нагретой средой
и перенесите три "лучших" эмбриона в теплую "большую круглую каплю".
5. Вылейте содержимое одной пробирки среды для переноса в чашку Петри
(Falcon).
6. Заполните стерильный шприц на 1 мл этой средой и положите на бок,
проследив за тем, чтобы его конец не прикасался к нестерильной
поверхности.
7. Извлеките из стерильного пакета катетер для переноса (Bourn-Wallace;
HG Wallace Ltd), разрезав концы пакета чистыми ножницами. Сначала
разрежьте упаковку на конце, где находятся розовые коннекторы. Уберите
белую пластиковую пробирку и присоедините шприц, наполненный средой.
Разрежьте упаковку со стороны катетера и продвиньте канюлю к новому
