Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 147

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 141 142 143 144 145 146 < 147 > 148 149 150 151 152 153 .. 162 >> Следующая

камеры позволяют сделать прямую оценку концентрации подвижных
сперматозоидов. Одна из них - камера Меклера (Sefi Medical Instruments)
очень удобна, но дорога. Камера Хоруэлла (Horwell Fertility Counting
Chamber, A. R. Horwell) дешевле и основана на простых принципах. При
глубине камеры 10 мкм и учитываемой площади в 1 мм2, разделенной на сотню
квадратов 100ХЮ0 мкм, число сперматозоидов, содержащихся в любых 10
маленьких квадратах, представит концентрацию сперматозоидов в
миллионах/мл. 3-5-мл аликвоту неразбавленного образца семени помещают на
счетную область камеры и закрывают покровным стеклом.
Таблица 14.5. Анализ семенн
1. Перенесите образец семенн из контейнера для сбора в градуированную
коническую пластиковую центрифужную пробирку (Falcon 2095). При этом
обратите внимание на вязкость образца. Объем и степень вязкости
зарегистрируйте.
2. Снабдив пипетку определенного объема стерильным пластиковым
наконечником, перенесите 50 мкл семени для счета в 950 мкл 10%-ного
забуференного формалина (в разведении 1:20). Воспользовавшись новым
стерильным наконечником, поместите 10 мкл семени на предметное стекло и
закройте стандартным покровным стеклом 22x22 мм для изучения подвижности
и морфологии (пп. 6 и 7).
3. Установите покровное стекло гемоцитометра над счетной камерой
(Improved Neubauer Haemocytometer). О правильном положении покровного
стекла свидетельствуют интерференционные кольца между противолежащими
поверхностями стекол.
4. Перенесите пастеровской пипеткой около 10 мкл заформалинениого образца
для подсчета в гемоцитометре - камера заполняется в результате действия
сил капиллярности.
5. Оставьте счетную камеру на 10 мин в увлажненной среде, чтобы
сперматозоиды осели на счетную сетку.
6. Тем временем проанализируйте подвижность спермиев. На стекле,
приготовленном в п. 2, под фазовым контрастом при увеличении Х250
просмотрите сто спермиев. Те из них, которые проявляют движение,
учитываются как подвижные.
7. Оцените морфологию спермиев (см. рис. 14.5), изучив их с помощью
фазового контраста при увеличении Х400. Отметьте спермин с одним или
более дефектов как аномальные.
8. Теперь оцените концентрацию спермиев путем подсчета их числа в четырех
больших угловых квадратах и в центральном квадрате каждой из двух сеток
камеры гемоцитометра (одна сетка показана на рис. 14.4). При этом
спермин, касающиеся верхних или левых линий квадрата, включаются в счет,
а те, что прикасаются к нижним или правым линиям квадрата, не считаются.
¦9. При разведении 1 : 20 концентрация спермиев, присутствовавших в
исходном образце семени, является средним от общего числа в пяти
квадратах каждой из двух сеток камеры, выраженным в млн./мл. Если
полученное число оказалось меньше 20 млн./мл, это означает, что способ
оценки концентрации спермиев неточен. В таком случае рекомендуется
просчитать все 50 квадратов камеры (т. е. 25 квадратов каждой из сеток).
Концентрация спермиев в исходном образце, оцененная этим методом,
выражается общим числом, полученным для 50 квадратов, разделенным на
десять и выраженным в млн./мл.
10. Если число оказалось низким, подсчет следует повторить с меньшим
разведением спермиев, внеся соответствующие коррективы.
11. Подсчитайте также округлые клетки (лейкоциты и незрелые сперматоген-
ные формы) в 50 квадратах. Если их количество превысит 2 млн./мл,
окрасьте стекло на лейкоциты для выявления пиоспермии и культивируйте
аликвоту для проверки на присутствие бактерий. Лучший краситель для
лейкоцитов-бензидин-цианозин-пероксидаза [30], однако бензидин
канцерогенен. Можно воспользоваться предокрашенными предметными стеклами
(Boehringer Manheim).
Оплодотворение ооцитов человека
377
Концентрация подвижных сперматозоидов оценивается с помощью фазово-
контрастного устройства. Эта камера особенно удобна в тех случаях, когда
число сперматозоидов в образце невелико и требуется только
приблизительный подсчет числа подвижных сперматозоидов, например, в
образце для осеменения после разделения в перколле или применения метода
"флотации" (см. ниже).
6.2.3. Нормальные характеристики семени
Несмотря на недостаточную четкость в определении критериев "нормальности"
спермы, Всемирная организация здравоохранения рекомендует следующие
стандарты, характеризующие "нормальный" образец [30].
Объем 2-5 мл
Время разжижения В пределах 30 мин
20-200 млн./мл Более 40% подвижны Более 40% нормальных форм Менее 1.
млн./мл
Концентрация
Подвижность
Морфология
Лейкоциты
6.2.4. Бактериологический скрининг
В некоторых лабораториях все образцы семени для оплодотворения in vitro
проходят бактериологический скрининг. При всех достоинствах этой
практики, позволяющей обнаружить прежде не выявленные заболевания,
переносимые половым путем, трудность лечения некоторых инфекций (Clamydia
Ureaplasma), а также возможность заражения после скрининга не гарантируют
неинфекционности образца во время процедуры оплодотворения. Образцы с
Предыдущая << 1 .. 141 142 143 144 145 146 < 147 > 148 149 150 151 152 153 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed