Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
немедленно перенести в среду для оплодотворения in vitro (т. е. 1 мл
EBS+БСА/сыворотка под маслом в течение ночи 5% С02 в воздухе). Оооцит
переносят стерильной стеклянной пастеровской пипеткой с гладким
оплавленным концом. Если в аспирате присутствует много эритроцитов, ооцпт
следует отмыть в чистой капле среды. Перед осеменением ооцит инкубируют в
течение 4-5 ч. Показано, что эта процедура повышает оплодотворяемость
[24].
5.2. Градация ооцитов
Применяемые режимы суперовуляции приводят к появлению популяции
фолликулов, не отличающихся полной синхронно-¦стью развития. Несмотря на
разрушение зародышевого пузырь-
Рис. 14.3. А. Зрелый человеческий предовуляторный ооцит. Обратите
внимание на обширную массу кумулюсных клеток, окружающую ооцит и
маскирующую его морфологию. Б. Незрелый человеческий ооцит с плотно
упакованными клетками кумулюса. В. Оплодотворенный человеческий ооцит;
видны два пронуклеуса (20 ч после осеменения). Г. Ооцит с тремя
пронуклеусами (19 ч после осеменения). Д. 2-клеточиый эмбрион (40 ч после
осеменения). Е. 4-клеточный эмбрион (46 ч после осеменения). Ж. 8-
клеточнын эмбрион (74 ч после осеменения). 3. Бластоциста (138 ч после
осеменения).
Оплодотворение ооцитов человека
371
ка вследствие предоперационной инъекции чХГ, степень зрелости цитоплазмы
ооцита может оказаться недостаточной для инициации нормального
эмбрионального развития [25].
Зрелый предовуляторный ооцит (рис. 14.3,Л), полученный при аспирации,
находится в метафазе II второго мейотического деления. Сам
предовуляторный фолликул крупный (его средний диаметр 2,2-2,8 см) и
содержит 3-10 мл жидкости [26]. Масса клеток кумулюса, окружающая ооцит,
увеличена за счет цементирующей их слизи. Незрелые ооциты (рис. 14.3,5)
обычно вымываются из фолликулов меньшего объема (<2 мл) и еще могут иметь
зародышевый пузырек. Клетки кумулюса, окружающие такой ооцит, плотно
прилегают к его поверхности и с трудом отделяются, даже после контакта со
сперматозоидами в течение 18 ч и более. Однако накапливаются сведения о
том, что у части таких незрелых ооцитов после культивирования в течение
12-36 ч может произойти созревание in vitro [27]. Несмотря на то что
оплодотворяемость ооцитов, созревших in vitro, снижена, иногда происходит
развитие in vitro до стадии бластоцисты. Способность эмбрионов,
развившихся из ооцитов, которые прошли созревание in vitro, дать начало
беременности, снижена [28].
5.3. Удаление клеток кумулюса
Детальное изучение морфологии предовуляционного ооцита затруднено из-за
большой массы кумулюсных клеток, маскирующих ооцит (рис. 14.3,Л). Хотя
некоторые заключения о состоянии зрелости ооцита можно сделать на основе
характеристики кумулюсной массы, о точной стадии созревания невозможно
судить, не удалив клетки кумулюса. Последние работы свидетельствуют о
том, что удаление клеток кумулюса до осеменения не препятствует
оплодотворению и позволяет оценить развитие ооцита по выделению первого
полярного тельца. Таким образом можно определить время инкубации,
необходимое для полного созревания перед осеменением [27, 28]. Для
удаления клеток кумулюса можно воспользоваться гиалуронида-зой (см. гл.
2, разд. 2.1). Следует заметить, что у некоторых линий мышей обработка
ооцитов гиалуронидазой вызывает иногда партеногенетическую активацию.
Как правило, удаление кумулюсной массы перед добавлением сперматозоидов
не проводится. Если ооциты находятся в присутствии сперматозоидов в
течение 12 ч или более, клетки кумулюса большинства ооцитов отделяются
спонтанно под действием гиалуронидазы сперматозоидов, кроме того, их
отделению может способствовать осторожное пипетирование стеклянной
пастеровской пипеткой, диаметр оттянутого конца у ко-
372
Глава 14
торой чуть больше диаметра ооцита. Оставшиеся кумулюсные клетки удаляют
механически с помощью инъекционных игл 27-го калибра.
5.4. Удаление блестящей оболочки
Для некоторых видов анализа строения эмбриона или ооцита (например, для
кариотипирования или для иммуноцитохими-ческой локализации) может
потребоваться удаление блестящей оболочки. Блестящая оболочка человека
обладает большей устойчивостью, чем мышиная, но и она может быть
растворена в теплой кислотной среде (например, в кислом растворе Тиро-де)
или при инкубации в течение 5 мин в растворе проназы (концентрацией 0,2
мг/мл) (см. гл. 2, разд. 3.2.1).
6. Сперматозоиды
6.1. Сбор образца семени
6.1.1. Контейнеры
Сбор образца семени производится путем мастурбации в широкогорлый
стерильный пластиковый контейнер (Sterilin, 60 мл). На контейнере должно
быть четко обозначено имя пациента, больничный номер, время получения и
дата предыду^ щей эякуляции или коитуса.
6.1.2. Инструкции
Каждый пациент должен быть снабжен инструктивным листом, в котором
объясняется способ получения образца и доставки его в лабораторию. Для
сбора семени нельзя пользоваться презервативами, так как они обычно
содержат спермици-ды. Нельзя пользоваться мазями, например "KY-желе",
