Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Точное измерение pH необязательно. Вполне достаточно реакции окрашивания
с фосфатным буфером Соренсена, где роль индикатора играет феноловый
красный (табл. 13.9).
3. Внесите пипеткой 100 мкл среды в 60-мм пластиковую чашку Петри
(Falcon).
4. Окружите (но не закрывайте) каплю теплым, пре-газован-ным парафиновым
маслом.
5. Добавьте 300 мкл Тб + БСА к первой капле.
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши____________347
Таблица 13.8. Состав среды Тб, используемой для оплодотворения in vitro
Компонент г/л мМ
NaCl 5,719 97,84
КС1 0,106 1,42
MgCl2-6H20 0,096 0,47
Na2HP04-12H20 0,129 0,36
СаС12-2Н20 0,262 1,78
КаНСОз 2,101 25,00
Лактат Na!) 2,791 24,90
Пируват Na2) 0,052 0,47
Глюкоза 1,000 5,56
Пенициллин G (соль калия) 0,060 -
Сульфат стрептомицина 0,050 -
¦Феноловый красный 0,010 -
Тб представляет собой модифицированный раствор Тнроде. !) Sigma grade DI-
V, 60%-иый сироп.
*) Calbiochem-Boehring.
6. Наслоите на каплю парафиновое масло.
7. Инкубируйте при 37 °С в воздухе с 5% С02, пока не будет готова
суспензия спермиев.
6.2.3. Источник и сбор спермы
Оплодотворяющая способность спермиев зависит от линии мышей; обычно в
качестве доноров спермы предпочитают гибридных самцов F, от скрещивания
C57BL/6XCBA/Ca. Используются половозрелые, проверенные самцы,
находившиеся отдельно от самок в течение 2 нед. Готовят две суспензии
спермиев. Соберите и диспергируйте спермин, как описано ниже. Работайте
быстро и пользуйтесь нагревательным столиком при 37 °С для поддержания
нужной температуры среды.
1. Отпрепарируйте от каждого из доноров один хвост придатка яичка (cauda
epididimis) и один семявыносящий проток (vas deferens).
2. Положите вырезанную ткань на лабораторную салфетку, чтобы промокнуть
кровь.
3. Поместите ткани в 1 мл теплой Тб под маслом.
4. Вырежьте оставшиеся caudae+vasa deferentia и поместите во вторую
аликвоту Тб.
5. Под контролем препаровального микроскопа осторожно извлеките сперму из
vasa deferentia, воспользовавшись двумя тонкими пинцетами. Проколите
ткань концами пинцета и выдавите сперму. Уберите ткань.
23'
348
Глава 13
Таблица 13.9. Приготовление фосфатного буфера Соренсена
для стандартного определения pH
1. Приготовьте исходный раствор А (1/15М КН2Р04): 9,08 г КН2Р04, 10 мг
фенолового красного, дважды дистиллированной в стеклянной посуде Н20 до 1
л.
2. Приготовьте исходный раствор Б (1/15М Na2HP04): 11,8 г Ма2НР04-2Н20,
10 мг фенолового красного, дважды дистиллированной в стеклянной посуде
Н20 до 1 л.
3. Приготовьте растворы с известным pH, смешивая аликвоты исходных
растворов А и Б.
pH (при 18 °С) Исходный раствор А, мл Исходный раствор Б, мл
6,6 62,7 37,3
6,8 50,8 49,2
7,0 39,2 60,8
7,2 28,5 71,5
7,4 19,6 80,4
7,6 13,2 86,8
4. Проверьте pH с помощью pH-метра и, если нужно, доведите, внеся
аликвоты нужного раствора (А - для понижения pH, Б - для повышения pH).
5. Стерилизуйте аликвоты каждого раствора фильтрацией через мнллипоро-вый
фильтр в пробирки для проб Falcon.
6. Храните при 4 °С.
7. Растворы не меняют pH в течение ~6 мес.
6. Инкубируйте сперму при 37 °С во влажной атмосфере с 5% СОг в воздухе в
течение 25 мин.
7. Выберите лучше диспергированную и с более активными спермиями
суспензию и оцените концентрацию спермиев с помощью гемоцитометра.
8. Разведите суспензию спермиев в приготовленной капле для оплодотворения
(разд. 6.2.2) до конечной концентрации 1-2ХЮ6 мл.
6.2.4. Инкубация оттаявших ооцитов с капаситированными спермиями
Оттаявшие ооциты инкубируют с капаситированными спермиями в течение 4 ч.
В описанных здесь условиях капаситация спермиев мыши происходит примерно
через 2 ч после сбора. Мы рекомендуем следующую процедуру:
1. После удаления ДМСО (см. разд. 3.6) поместите оттаявшие ооциты в М2
при 37 °С в воздухе.
2. Через 2 ч после сбора спермы промойте ооциты в Т6+ +БСА, чтобы удалить
все следы буфера HEPES.
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши
349
3. Перенесите ооциты в минимальном объеме среды в каплю для
оплодотворения (- 100 ооцитов на каплю).
4. Инкубируйте в течение 4 ч при 37 °С с 5% ССЬ в воздухе.
6.2.S. Культивирование оплодотворенных ооцитов и перенос эмбрионов
1. После 4 ч инкубации соберите ооциты из каплн и отмойте от спермиев,
дважды сменив среду М16+БСА (гл. 2, разд. 5.2).
2. Культивируйте в каплях среды М16+БСА под маслом.
3. На следующий день перенесите 2-клеточные эмбрионы в яйцеводы
псевдобеременных самок дня 1 (разд. 6.4.5).
6.3. Эмбрионы
Жизнеспособность эмбрионов, сохранявшихся в ЖА, в конечном счете
оценивается по развитию из них живых мышей. Однако морфологические
признаки оттаявших эмбрионов, их способность продолжить дробление in
vitro хорошо коррелируют с их жизнеспособностью после переноса
реципиенту. Такая промежуточная оценка эмбрионов дает возможность
сэкономить время и средства, затрачиваемые на перенос дефектных
эмбрионов. Более того, эмбриональное развитие после оттаивания, по-
видимому, происходит с меньшей скоростью. Культивирование in vitro
