Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 133

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 127 128 129 130 131 132 < 133 > 134 135 136 137 138 139 .. 162 >> Следующая

ниже той, которая вызывает изменение физического состояния раствора (-120
°С), чтобы избежать повреждения эмбрионов в результате девитрификации. На
долговременное хранение витрификационные образцы лучше закладывать в
пайеты, погруженные в ЖА (см. разд. 5).
4.5. Нагрев
Чтобы избежать повреждающего действия девитрификации, длительно
хранившиеся витрифицированные суспензии должны быть быстро нагреты (>200
°С/мин) [8, 23]. Одним из удобных способов служит перенос образца в
холодную (4°С) воду. При этом скорость нагрева составит около 2000°С/мин.
Не пользуйтесь нагревающей водяной баней; даже временное повышение
температуры суспензии может привести к химической токсичности и
поступлению избыточных количеств крио-протекторов в клетку.
4.6. Разведение витрификационного раствора
Следует уделить серьезное внимание освобождению эмбрионов от
витрификационного раствора, поскольку известно, что его высокие
концентрации токсичны. Важно обеспечить условия, при которых температура
эмбриональной суспензии не поднимается выше 4°С до тех пор, пока
разведение криопротекторов не достигнет по крайней мере 25% от исходной
концентрации ВР1. Быстрого разбавления путем переноса эмбрионов в
изотонический раствор следует избегать: это может привести к повреждению
эмбриона в результате осмотического разбухания.
Среду, предохраняющую эмбрионы от разрушения, можно создать разбавлением
криопротекторов одним из указанных способов.
1. Медленно, посредством ступенчатой процедуры ([23], табл. 13.6,А).
Концентрация витрификационного раствора уменьшается в два приема при 4°С,
пока не достигнет 25% концентрации исходного ВР1. Затем оставшиеся
внутри- и внеклеточные криопротекторы медленно разбавляются в несколько
приемов при комнатной температуре.
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши
343
Таблица 13.6. Освобождение эмбрионов от витрификациоиного раствора
Нагрейте эмбрионы и проведите первоначальное разбавление при 4°С. Сразу
после нагревания осушите пайеты салфеткой и срежьте оплавленные концы.
Удалите криопротекторы одним из приведенных ниже способов.
А. Процедура ступенчатого разбавления
1. Вылейте содержимое пайеты в маленькую чашку Петри с 3 мл холодного
(4°С) 50%-ного ВР1 и сполосните пайету 50%-ным ВР1. Тщательно перемешайте
содержимое чашки и подождите 10 мнн.
2. Перенесите эмбрионы микропипеткой в 3 мл холодного 25%-ного ВР1.
Тщательно перемешайте н подождите 10 мин.
3. Принесите суспензию эмбрионов нз холодной комнаты и подождите 10 мин.
4. Перенесите эмбрионы в 3 мл 12,5%-ного ВР1 (разведение 1:8 исходного
ВР1 буферным раствором НВ1, табл. 13.4). Смешайте, подождите 10 мин.
5. Перенесите эмбрионы в ВР1 или М2 и оставьте на 10 мин, прежде чем
перейти к следующей процедуре.
Б. Процедура "сахарозного" разбавления
1. Вылейте содержимое пайеты в маленькую чашку Петри с 3 мл раствора
холодной (4°С) 1,08 М сахарозы в РВ1. Тщательно перемешайте (эмбрионы
будут плавать) н оставьте на 5 мин.
2. Принесите суспензию эмбрионов из холодной комнаты и подождите 10 мин.
3. Перенесите "сжавшиеся" эмбрионы в РВ1 илн М2.
2. Быстро, посредством "сахарозной" процедуры ([8], табл. 13.6,5),
основанной на методе, который предложили Лейбо и Мейзур [9].
Витрификационный раствор заменяется при 4°С солевым раствором, в состав
которого входит 1,08М сахароза. Сахароза не проникает в бластомеры,
создавая таким образом осмотический барьер, препятствующий излишнему
разбуханию эмбрионов по мере того, как крнопротекторы выходят из
цитоплазмы.
4.7. Техника безопасности
1. Точно следуйте инструкции изготовителя прн работе с ацетамидом.
2. Придерживайтесь правил работы с жидким азотом (см. разд. 3.7).
5. Хранение образцов
Замороженные и витрификационные эмбрионы хранят при -196 °С в любом
доступном хранилище для ЖА. Следует убедиться в том, что уровень ЖА
достаточен. Желательно контролировать температуру или вес сосуда, чтобы
не допустить паде-
344
Глава 13
ния уровня ЖА до опасного предела. Кроме того, для страховки от возможной
потери лучше держать эмбрионы одной линии мышей более чем в одном
хранилище.
5.1. Длительность хранения
При -196 °С могут происходить только фотофизические реакции, т. е.
ионизация вследствие радиации. При отсутствии процессов ферментативной
репарации в период длительного хранения в эмбрионах могут накапливаться
летальные количества повреждений. Однако до сих пор не получено каких-
либо аргументов в пользу этого предположения. Нормальные фертильные мыши
развились из 8-клеточных эмбрионов, хранившихся в ЖА до 13 лет. Более
того, длительное хранение замороженных эмбрионов в условиях, имитирующих
нормальную фоновую радиацию, накапливаемую в течение 2000 лет, не вызвало
никаких генетических отклонений [27].
5.2. Регистрация
Необходима правильная и полная регистрация данных о хранящемся материале.
Может оказаться так, что размораживать эмбрионы будет кто-то другой.
Минимально необходимая информация включает следующие данные: дата
Предыдущая << 1 .. 127 128 129 130 131 132 < 133 > 134 135 136 137 138 139 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed