Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 128

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 162 >> Следующая

предположить, что эти вещества предохраняют эмбрион от повреждающего
действия высоких концентраций растворов, которые создаются в результате
вымораживания воды в суспензионной среде.
3.2.1. Выбор криопротектора
Защитное действие на замораживаемые неоплодотворенные яйца и эмбрионы
мыши оказывает целый ряд проникающих соединений, включая ДМСО, глицерол,
метанол, пропиленгли-коль и полиэтиленгликоль [1,16,17,18,19]. Для
неоплодотво-ренных яиц эффективными криопротекторами служат ДМСО или
глицерол [3, 20]. В нашей лаборатории для замораживания ооцитов и
эмбрионов по многим причинам используют ДМСО.
1. До сих пор живых мышей удалось получить только из тех ооцитов, которые
были законсервированы с использованием в качестве криопротектора именно
ДМСО [3, 21].
2. После замораживания в присутствии ДМСО эмбрионы всех
предимплантационных стадий развиваются нормально.
3. Процедуры добавления и удаления ДМСО сравнительно просты. Это
обстоятельство особенно важно для новичков и для использования метода в
лабораториях, где замораживание требуется в редких случаях.
4. Высокий уровень выживаемости после оттаивания. Обычно 50% эмбрионов от
случайно скрещивающихся мышей и до 30% эмбрионов, полученных от инбредных
мышей, нормально развиваются после замораживания на 8-клеточной стадии.
Пропорция оттаявших ооцитов, способных оплодотворяться in vitro, отчасти
зависит от генотипа
спермия и варьирует от 1 до 60%- После переноса примерно 50%
оплодотворенных яиц дают нормальные плоды.
5. Безопасность длительного хранения в ДМСО доказана (разд. 5.1).
На выживаемость эмбрионов влияют:
а) концентрации криопротектора;
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши____________331
б) скорость и температура, при которых криопротектор вносится в образец,
а также время экспозиции перед охлаждением до субнулевых температур;
в) скорость и температура, при которых протектор удаляется после
оттаивания (разд. 3.6).
3.2.2. Концентрация ДМСО
Высокая выживаемость эмбрионов наблюдается после замораживания в среде,
содержащей ДМСО в концентрации от
1.0 до 2,0 М. В концентрациях меньше 1,0 М ДМСО не проявляет эффективного
защитного действия, а в концентрациях выше
2.0 М ДМСО оказывается токсичным. На практике используется концентрация
1,5 М.
3.2.3. Добавление ДМСО
При смешивании ДМСО с замораживаемой средой выделяется значительное
количество тепла. Поэтому прямо в образец, содержащий эмбрионы,
неразведенный ДМСО не вносится; вместо этого готовят его 3,0 М раствор
(табл. 13.3) и к образцу добавляется аликвота, достаточная для получения
конечной концентрации ДМСО 1,5 М. К образцам, представленным
неоплодотворенными яйцами или эмбрионами вплоть до стадии морулы, весь
необходимый объем добавляется сразу при 0°С (табл. 13.3,/4). Если
консервируются бластоцисты, их выживаемость повышается при постепенном
увеличении концентрации ДМСО при комнатной температуре (табл. 13.3,5).
В настоящее время известно, что если перед замораживанием создать
условия, соответствующие проникновению гли-церола, это приведет к
увеличению выживаемости ооцитов мыши [9]. Количество вещества,
поступающего в эмбрион, определяется его проницаемостью, временем и
температурой экспозиции перед замораживанием. При воздействии ДМСО время
п температура экспозиции не имеют столь критического значения, как при
действии глицерола (вероятно, это следствие лучшей проникающей
способности ДМСО). Оптимальный уровень выживаемости мышиных эмбрионов 8-
клеточной стадии достигается после 5-минутной экспозиции при 0°С.
Длительное воздействие (до 30 мин) при 0°С не снижает выживаемости и
оказывается более удобным при установившейся практике замораживания
эмбрионов. После добавления ДМСО мы выдерживаем эмбрионы на льду в
течение 15 мин. Тем временем следует:
а) быстро извлечь ампулу из ледяной бани и, удерживая ее длинным
пинцетом, запаять;
332
Глава 13
Таблица 13.3. Приготовление ДМСО и добавление его перед замораживанием
Приготовление 3,0 М ДМСО
Предпочтительнее использовать ДМСО для спектроскопического анализа.
1. Наберите пипеткой 7,87 мл среды (РВ1 или М2) в пластиковую пробирку
для проб Falcon.
2. Добавьте 2,13 мл ДМСО.
3. Перемешайте осторожно, чтобы избежать денатурации БСА в среде.
4. Стерилизуйте, воспользовавшись миллипоровым фильтром с размером пор
0,22 мкм.
Добавление ДМСО к мышиным ооцитам и эмбрионам от 1-клеточной стадии до
морулы
1. Охладите 3,0 М ДМСО до 0 "С.
2. Пипеткой перенесите эмбрионы в ампулу, содержащую 0,15 мл М2, и
охлаждайте до 0°С (примерно 10 мин).
3. Добавьте 0,15 мл 3,0 М ДМСО.
4. Тщательно перемешайте.
5. Через 15 мии перенесите образец в баню для сидиига.
Добавление ДМСО к бластоцистам мыши
1. Дайте нагреться 3,0 М ДМСО до комнатной температуры.
2. Внесите пипеткой эмбрионы в ампулу, содержащую 0,15 мл среды М2 при
комнатной температуре.
3. Добавьте 0,05 мл 3,0 М ДМСО.
4. Тщательно перемешайте.
5. Подождите 5 мин.
6. Повторите пп. 3, 4, и 5.
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed