Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
кумулюса постепенно диссоциируют и освободят яйцо. Этот процесс можно
ускорить осторожным пипети-рованием скопления яиц широкой стеклянной
пипеткой. Охлаждение и гиалуронидаза могут активировать неоп-
лодотворенные яйца, поэтому растворы должны быть теплыми, а воздействие
гиалуронидазой сокращено до минимума.
4. После того, как яйца осядут на дно чашки, удалите как можно больший
объем раствора гиалуронидазы н замените его теплой средой М2+БСА,
соберите яйца пипеткой и отмойте их от клеток кумулюса, проведя несколько
раз через среду М2 + БСА.
5. В тех случаях, когда нужно собрать тысячи яиц (например, для выделения
РНК, см. гл. 9), более эффективным способом удаления клеток кумулюса
служит нейлоновая
30
Глава 2
сетка (размер ячеек около 20-30 мкм), вставленная в основание цилиндра
пластикового шприца на 5-10 мл. Смочите сетку средой, пропустите среду с
яйцами через это сито и соберите в чашку Петри прошедший через ячейки
раствор с клетками кумулюса. В результате этой процедуры яйца окажутся
почти свободными от клеток кумулюса. Для удаления их остатков следует
воспользоваться пипеткой.
6. Если в течение 10 ч после инъекции чХГ яйца не будут извлечены из
яйцеводов, эндогенные энзимы высвободят массы кумулюсных клеток. В этом
случае разумно прибегнуть к получению яиц методом вымывания, описанным в
разд. 2.2 для дробящихся стадий, с использованием при необходимости
гиалуронидазы.
Оплодотворенные яйца отличаются от неоплодотворенных присутствием хорошо
заметного второго полярного тельца (рис. 2.1,5) (первое полярное тельце у
многих линий мышей часто дегенерирует). Для определения стадий развития
оплодотворенных яиц используют такие признаки, как наличие и положение
мужского и женского пронуклеусов (рис. 2.1). Последовательность событий
во время первого клеточного цикла (см. табл. 2.1) запускается
оплодотворением и не зависит от времени; овуляции [ 8J. Рекомендуется
избегать оплодотворения яиц, овулировавших более 12 ч назад, .так как с
возрастом яиц увеличивается вероятность их партеногенетической активации
(гл. 12).
2.1.2. Оплодотворение in vitro
Описанный способ получения яиц и эмбрионов удобен в двух отношениях. Во-
первых, он обеспечивает большую синхронность популяции, чем спаривание in
vivo, так как момент оплодотворения [8] можно, точно зарегистрировать.
Во-вторых, вся процедура перестает быть связанной с циклом смены дня и
ночи, и исследователь так выбирает время осеменения, чтобы интересующая
его стадия развития пришлась на рабочий день. Детали процедуры см. в гл.
13, разд. 6.2. Мы пользуемся сходной методикой, поэтому на ней не
останавливаемся.
Данные по первым пяти клеточным циклам получены для •единичных клеток или
пар клеток, синхронизированных в отношении предыдущего деления. Данные по
более поздним циклам получены на интактных эмбрионах и поэтому более
вариабельны. Циклы 1 и 2 описаны для гибридов C57BL/CBA, а более поздние
циклы - для аутбредных мышей MFI. Все временные характеристики основаны
на наблюдениях над группой эмбрионов.
Рис. 2.t. Морфология развития нормального предимплантационного эмбриона
мыши. Временные характеристики представлены в табл. 2.1. 1. Предойулятор-
ный ооцит с ннтактным зародышевым пузырьком. 2. Предовуляторный ооцнт с
разрушенным зародышевым пузырьком. 3,4. Выделение первого полярного-
тельца и следующие за иим овуляция н оплодотворение. 5. Продолжение мей-
оза женским набором хромосом и выделение второго полярного тельца, о. 6.
Деконденсацня ядра спермия н формирование мужского пронуклеуса.
7. Формирование ядерной мембраны вокруг гаплоидного набора женских
хромосом н образование женского пронуклеуса; последний занимает
субкортикальное положение вблизи второго полярного тельца и имеет меньшие
размеры по сравнению с мужским пронуклеусом. 8-10. Миграция проиуклеусов
к центру яйца; репликация ДНК. 11,12. Разрушение мембран пронуклеусов;
складчатость поверхности эмбриона указывает на реорганизацию цитоскелета,
предшествующую делению. 13. Удлинение эмбриона. 14, 15. Формирование
перетяжки. 16. Новообразованный 2-клеточный эмбрион с различимыми ядрами.
17. Более поздняя 2-клеточиая стадия с четкими ядрами. 18-25. Более
поздние стадии предимплантационного развития: 18 - 4-клеточиый эмбрион;
19, 20 - 6-8-клеточные эмбрионы; 21-компактизированный 8-клеточный
эмбрион; 22 - переход от 8-клеточного компактизнрованного эмбриона к 16-
кле-точиому; 23, 24 - ранняя бластоциста; 25 - поздняя бластоциста (более
детально изображена иа рис. 2.2), (Воспроизводится по работе [7].)
Таблица 2.1. Временная последовательность событий при развитии')
Временная характеристика развития
Часы после осеменения Часы после инъекции чХГ
Первый клеточный цикл [8] (1-клеточная стадия) Завершение мейоза 11
Разрыв зародышевого пузырька и овуляция Период G[ Выделение второго ПТ
Формирование мужского проиук-леуса Формирование женского (меньшего)
пронуклеуса Миграции проиуклеуса к центру Период S Период G2/M
