Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
В последние годы интерес к таким исследованиям возобновился. При изучении микрофлоры горячих источников Бурятии с температурой воды 50—60 °С выявлено, что ил и вода содержат анаэробные термофильные спорообразующие бактерии. Накопительные культуры целлюлолитических бактерий получены из образцов, содержащих ил или растительные остатки. Из накопительных культур выделена чистая культура Clostridium thermocellum. Выявлено, что вегетативные и спорулирую-щие клетки бактерий в начале ферментации плотно прикрепляются к целлюлозе. В процессе ферментации клетки освобождаются от нее, переходят в культуральную жидкость. Изучены цитологические особенности вегетативных клеток и спор Clostridium thermocellum. Толщина кортекса спор значительно превышает его толщину у мезофнльных бактерий, что, по-видимому, обусловливает их термоустойчивость (Храпцова, 1986).
Поиск, выделение и идентификация природных штаммов термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов проведены также Чувильской (1986). Из почвы и ила выделено пять штаммов Clostridium thermocellum. Они имеют сходные морфологию и культуральные свойства, близки по суммарному содержанию гуанина и цитозина в ДНК (37—40 мол.%), составу продуктов ферментации целлюлозы и целлобиозы. Штаммы различаются по скорости роста, накоплению биомассы, активности целлюлаз, а также по количеству и соотношению накапливаемых продуктов.
Физиолого-биохимические особенности. Новые методы культивирования анаэробов и определения активности ряда ферментов способствовали успехам в выделении чистых культур термофильных целлюлозоразлагающих анаэробных бактерий и изучении их физиологии и биохимии (Hungate 1969).
Термофильные анаэробные бактерии как в чистой, так и в смешанной культурах активно разрушают целлюлозосодержащие субстраты. Однако в ранних исследованиях все попытки обнаружить в фильтратах культуральной жидкости целлюлолитические ферменты не увенчались успехом. Было высказано предположение, что вокруг бактериальной клетки создается активная зона с высокой концентрацией целлюлазы, но она находится в непосредственном контакте с клеточной стенкой (Им-шенецкий, 1953).
185
Enebo (1951) в опытах с чистой культурой Clostridium ther-mocellulaseum было показано, что в культуральной жидкости целлюлаза накапливается в значительных количествах при ферментации целлюлозы. Оптимальными для действия целлюлазы являются температура 55—60 °С и pH 5,6. Внеклеточная целлюлаза адсорбируется на измельченной целлюлозе. Ионы тяжелых металлов ингибируют целлюлазу, ингибирующий эффект уменьшается при добавлении к субстрату пептона.
Образование внеклеточных целлюлолитических ферментов изучено также и в опытах с накопительной культурой термофильных целлюлолитических бактерий. Установлено, что максимум активности целлюлаз совпадает с оптимальной температурой развития бактерий—65°С. Исследовано также образование целлюлолитических ферментов в зависимости от содержания в среде целлюлозы, времени сбраживания субстрата и температуры. Обнаружено, что целлюлолитическая активность резко возрастает в течение первых 3 сут в условиях культивирования бактерии на среде с целлюлозой при 60 °С (Верховцева, 1965; Логинова, 1966).
При определении скорости роста и образования целлюлаз Clostridium thermocellum выявлено, что изучаемые штаммы с одинаковой скоростью растут на среде с целлюлозой и целлобиозой. При культивировании на среде с целлюлозой синтезируется внеклеточная целлюлаза. Образование внеклеточной целлюлазы по времени совпадает с ростом и расщеплением целлюлозы (Ng et al., 1977).
Ait et al. (1977) из фильтрата культуральной жидкости анаэробных бактерий Clostridium thermocellum посредством препаративного электрофореза в полиакриламидном геле получен частично очищенный целлюлазный комплекс. В аналитическом диск-электрофорезе целлюлаза характеризуется одной белковой полосой с ММ 125 000+ 10000. Однако при электрофорезе в присутствии додецилсульфата целлюлаза диссоциирует по меньшей мере на пять белковых компонентов. Авторы предположили, что целлюлаза существует в виде мультиферментного комплекса.
Другие авторы при изучении образования целлюлазы выявили, что Clostridium thermocellum и мутантный штамм с большей продукцией целлюлазы образуют эндо-р-глюканазу и экзо-р-глюканазу при культивировании на питательной среде с целлюлозой или целлобиозой в качестве источника углерода. Не менее 95% целлюлазы накапливается в питательной среде. Подобрана питательная среда, позволяющая на 60% увеличить образование эндо-р-глюканазы (Garsia-Martines et al., 1980).
Проведена очистка и изучены свойства эндоглюканазы Clostridium thermocellum. Эндоглюканаза (КФ 3.2.1.4) была очищена, оптимум ее активности наблюдался при pH 5,2 и температуре 62 °С, наибольшую активность она проявляла по от-
186
ношению к карбоксиметилцеллюлозе, наименьшую—к микрокристаллической целлюлозе (Ng et al., 1981).
На ранней стадии роста Clostridium thermocellum на целлюлозе обнаруживается два основных целлюлолитических фер-метных комплекса. При электронномикроскопическом исследовании видны сферические частицы: большой комплекс (ММ 102-106) и малый комплекс (ММ 4,2¦ 106). На среде с целлюлозой целлюлолитическая ферментная система на ранних этапах роста связана с субстратом. После потребления целлюлозы связанные компоненты системы переходят в культуральную жидкость в виде свободных ферментов (Coughlan et al., 1985; Hon-nami et al., 1986).
