Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
С совершенствованием методов фракционирования целлюлолитических ферментов появилось много данных, свидетельствующих о множественности молекулярных форм компонентов, входящих в состав целлюлазного комплекса,— эндоглюканаз, целлобиогидролаз и целлобиаз. Эти формы отличаются изоэлект-рическими точками, молекулярной массой, содержанием углеводов, специфичностью действия и другими свойствами. Так, Черно-глазовым и др. (1985) показано, что молекулярные формы
44
эндоглюканазы Trichoderma viride обладают одинаковой и достаточно узкой субстратной специфичностью как к природе мономерного звена растворимого полисахарида, так и к типу гидролизуемой связи.
Внеклеточные кислые протеазы могут действовать на целлюлазу в процессе ферментации, если условия роста (pH и температура) недостаточно контролируются. Из результатов, полученных Dunne (1982), следует, что кислая протеаза из Trichoderma reesei — не единственный фактор, ответственный за существование множественных форм целлюлаз. Во-первых, целлюлазный спектр одинаков у штаммов гриба с высоким и низким уровнями образования протеаз, во-вторых, целлюлазы в естественной конформации (pH 4) устойчивы к действию протеаз. По мнению автора, роль кислых протеаз в секреции целлюлазы еще неясна. Имеются указания на то, что в активации эндоглюканаз у SpOrotrichum pulverulentum и других грибов определенную роль играют кислые протеазы, которые разрушают ингибитор эндоглюканазы белковой природы (Eriksson, Pettersson, 1982).
Мутация Trichoderma reesei приводит к изменению спектра секретируемых внеклеточных белков, хотя в меньшей степени это затрагивает число и индивидуальную активность компонентов целлюлазного комплекса (Farkas et al., 1982). Было установлено, что Trichoderma reesei секретирует множественные формы целлюлаз с самого начала культивирования. Существует мнение, что целлюлоза Trichoderma reesei — сложная система, состоящая из множественных целлюлазных компонентов, которые, по крайней мере частично, генетически детерминированы. Теоретически возможны посттрансляционная модификация компонентов под воздействием физических факторов или в результате гликозили-рования, а также высвобождение целлюлазных компонентов с остатков целлюлозы в конце культивирования (Labudova, Farkas, 1983).
Гомогенность внеклеточных белков Trichoderma reesei после изоэлектрофокусирования свидетельствует скорее о чистоте муль-тиферментного комплекса, чем о чистоте одного выделенного фермента. Наличие гетерогенности уже на самых ранних стадиях культивирования исключает объяснение этого явления постсек-реционной модификацией ферментов. Sprey, Lambert (1984) полагают, что макрогетерогенность является общим свойством внеклеточных экзогидролаз, характерным для многих грибов. Это подтверждается наблюдениями и других исследователей.
Willick et al. (1984) с помощью иммунопреципитации ферментов специфическими антителами обнаружили, что за секрецию р-глюкозидазы, авицеллазы и карбоксиметилцеллюлазы ответственны три гена. Другие молекулярные формы ферментов образуются в результате гликозилирования или под действием про-теолитических ферментов в процессе секреции или после нее. Известно, что грибы образуют много внеклеточных глюканаз.
45
Trichoderma reesei в молодой культуре или при индукции софо-розой образует только три или четыре глюканазы.
Множественность форм целлюлолитических ферментов была описана Okada et al. (1968) и Gong et al. (1979). Kolar et al. (1985), используя протопласты Trichoderma reesei, доказали, что множественные формы целлюлаз имеются уже в фазе секреции. Результаты Kolar et al. (1985) показывают, что некоторые из множественных компонентов целлюлазного комплекса проявляют и карбоксиметилцеллюлазную и р-гликозидазную активность в одной фракции, что как бы подтверждает предположение о том, что множественные компоненты являются многоферментными агрегатами (Sprey, Lambert, 1983, 1984).
Kolar et al. (1985) отмечают, что совпадение изоэлектричес-ких точек и соответствующие проявления карбоксиметилцеллю-лазной и глюкозидазной активности менее очевидны в культурах гриба на среде с целлюлозой. Возможны образование в периплаз* матическом пространстве многоферментных агрегатов вследствие их высокого сродства к полимерам клеточной стенки и последующая «фильтрация» ферментов из агрегатов через клеточную стенку в окружающую среду. Белецкая и др. (1985) полагают, что у Aspergillus terreus глюканазы секретируются в виде одного или более ферментов, из которых посредством последовательного гидролиза образуются низкомолекулярные гидролазы с измененной специфичностью. Предполагается протеолитическая природа такой модификации ферментов.
Эндоглюканазы Trichoderma reesei представлены рядом иммунологически родственных компонентов, Было показано, что это один и тот же фермент, модифицированный во взаимодействии с другими компонентами культуральной жидкости. Эти эн-доглюканазные компоненты, по мнению Niku-Paavola et al.
(1985), соответствуют ранее описанным изоферментным формам эндоглюканазы, так как их молекулярные свойства идентичны. Получены данные о том, что другие белки могут взаимодействовать с ферментами. Изученные глюканазы не проявляют активности по отношению к нерастворимым субстратам, поэтому их роль сводится к гидролизу растворимых форм целлюлозы. Поскольку очищенные целлюлазные компоненты взаимодействуют с другими белками культуральной жидкости, интерпретация результатов механизма действия целлюлаз, даже в случае использования только целлюлолитической системы грибов Trichoderma, часто затруднена из-за различия методов очистки и характеристик отдельных целлюлазных компонентов (Niku-Paavola, 1986).
