Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Целью этой главы является не обсуждение моделей активации В-клеток, а описание методик определения активности факторов, стимулирующих пролиферацию В-клеток. Для того чтобы методика тестирования была приемлемой, она должна отвечать ряду требований. В системе должно достигаться насыщение, т. е. кривая титрования активности должна иметь выход на плато. При разбавлении фактора эта кривая должна соответствовать одноударной кинетике, и, наконец, в предельных разведениях должен достигаться фоновый уровень.
II. МАТЕРИАЛЫ
а. Применение культуральных сред на основе RPMI 1640 или модифицированной Дульбекко минимальной среды с коррекцией по Искову дает примерно одинаковые результаты.
234 Глава 13
К этим средам добавляют антибиотики, р-меркаптоэтанол (5-10-5 М) и соответствующее количество сыворотки плода коровы (СПК) (см. ниже). К среде RPMI добавляют также L-глу-тамин и пируват до конечной концентрации 1%.
б. Партии СПК проверяют на митогенную активность и на способность поддерживать стимулированную митогенами пролиферацию лимфоцитов. Рутинное тестирование, применяемое в нашей лаборатории, включает стимуляцию спленоцитов мышей C57BL/6 в концентрации 1,5—10-105 клеток/мл липополи-сахаридом (ЛПС) или Кон-А. Сыворотку из новой партии титруют против сыворотки из уже проверенной партии, используемой в качестве стандарта, и через два дня культивирования определяют включение тимидина в стимулированных и нести-мулированных культурах. Кроме того, на четвертый и шестой день культивирования определяют синтез БОК IgM и IgG3 соответственно. С нашей точки зрения, наиболее чувствительным является именно последний тест, т. е. проводимый на шестой день культивирования. Обычно удается найти партию СПК, которая в концентрации 2,5—10% поддерживает индуцированную митогенами пролиферацию, вызывая при этом минимальное фоновое включение тимидина или образование БОК. Следует также отметить, что соответствующие тесты можно проводить и в бессывороточных средах, как это описали Исков и Мелхерс (Iscove, Melchers, 1978).
в. Для культивирования используют пластмассовую стандартную посуду и панели. Предварительно активированные культуры вносят или в лунки на 2 мл панелей фирмы Costar, или в культуральные матрасы. Повторное культивирование ведут в плоскодонных лунках панелей для микротитрования, причем при работе с панелями, производимыми разными фирмами, никаких различий не наблюдается. Если для подсчета клеток или для мечения радиоактивными аминокислотами необходимы большие количества клеток, для рекультивирования можно использовать панели Costar с лунками объемом 2 мл.
г. Клетки фракционируют в градиентах как фиколла, так и перколла. Обычная клеточная суспензия, приготовленная из селезенки мыши, содержит клетки, различающиеся по плотности в соответствии с различными стадиями активации. Исходя из этого, можно обогатить клеточную популяцию в отношении клеток, включающих 3Н-тимидин, или в отношении БОК, разделяя спленоциты по их размерам или плавучей плотности. Мы предпочитаем использовать градиенты плотности перколла, так как они обеспечивают хороший выход клеток, процедура разделения занимает мало времени и воспроизводима? а риск загрязнения минимален. Перколл (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция) поступает в продажу в жидком виде. 90 мл перколла
Тесты для выявления лимфокинов
235
смешивают с 8—9 мл 10ХЗФР и к этому раствору добавляют несколько капель фенолового красного. Добавлением 1 М НС1 pH доводят до 7,2—7,4. При этом кислоту следует вводить медленно при постоянном перемешивании, для того чтобы избежать преципитации перколла. Осмоляльность смеси доводят до 300—320 мосм/кг либо стерильной дистиллированной водой либо
10 X ЗФР. После этого объем смеси доводят до 100 мл ЗФР, и этот маточный раствор, который далее мы будем называть 100%-ным перколлом, может храниться в течение года при 4°С.
Для приготовления ступенчатого градиента 100%-ный маточный раствор перколла смешивают с ЗФР или сбалансированным солевым раствором (СР), чтобы получить 74%-ный (плотность 1,085), 68%-ный (1,080), 63%-ный (1,075) или 52%-ный
(1,060) растворы перколла. 2 мл каждого из растворов последовательно (в соответствии с уменьшающейся плотностью) наслаивают в коническую пробирку на 15 мл. Наконец, клетки, ресуспендированные в 5 мл СР, наносят на градиент и центрифугируют 30 мин при 1400 g. Клетки, локализованные в более низкой зоне — между 74%- и 68%-ным перколлом, собирают и после двух-трех промывок СР используют для тестирования пролиферативной активности. При использованном методе выход этих клеток составляет 5—20% общего числа взятых клеток.
Следует отметить, что структура градиента оказывает весьма существенное влияние на характер разделения клеток. Если, например, на слой с плотностью 1,085 нанести слой с плотностью
1,075, а не 1,08, то клеточная фракция, локализованная после центрифугирования над слоем с плотностью 1,075, будет содержать примеси всех тех клеток, плотность которых меньше 1,075, а не 1,08, и, таким образом, в препарате будет много более крупных клеток, имеющих меньшую плавучую плотность. Мы использовали также градиент, состоящий из 70, 60, 50 и 40%-ного перколла и получили хорошие результаты на фракции клеток, выделенной из 70% -ного перколла. Выход клеток при использовании такого градиента несколько выше по сравнению с предыдущим.
