Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Этот концентрированный раствор хранят в течение длительного времени при 4°С.
3. Среда для течения
Для того чтобы пометить около 20-106 клеток, непосредственно перед использованием смешивают: 18 мл концентрированной среды; 0,4 мл 0,2 М L-глутамина; 0,2 мл 0,1 М пирувата натрия;
220 Глава 12
0,2 мл 100Х смеси пенициллин — стрептомицин (Gibco номер ik> каталогу 043-5140); 0,8 мл 100ХМСИ с витаминами (Gibco, номер по каталогу 043-1120); 0,2 мл 10 мМ 2-меркаптоэтанола,
2 мКи Ь-[4,5-3Н]-лейцина в 2 мл стерильного раствора (Amers-ham TRK-510, >100 Ки/ммоль).
В. Биосинтетическое мечение
Из культуральных матрасов удаляют клетки гибридом в экспоненциальной фазе роста; при этом наиболее жизнеспособные клетки остаются прикрепленными к стенкам матрасов. Матрасы дополнительно промывают ГКН-буфером и новую порцию смытых клеток объединяют с клетками, полученными при первом удалении среды. К клеткам, оставшимся в матрасах,, добавляют 4 мл среды для мечения, предварительно подогретой до 37°С и насыщенной газовой смесью, состоящей из 7% Ог и 83% N2. Смытые с матрасов клетки центрифугируют, подсчитывают и однократно промывают в ГКН-буфере. После этого клетки ресуспендируют в подогретой среде для мечения и по 4—16 мл суспензии вносят обратно в каждый матрас площадью 75 см2 (Falcon, № 3024). Желательно, чтобы конечная концентрация составила 1—2-106 клеток/мл, включая и прикрепленные к стенкам клетки, число которых оценивают приблизительно. Матрасы еще раз заполняют газовой смесью, закрывают и инкубируют при 37°С. После гибели >90% клеток, что обычно наблюдается через 24 ч и реже через 48 ч (в зависимости от линии клеток), среду собирают, матрасы промывают 5 мл ГКН-буфера и объединяют эту порцию буфера с культуральной жидкостью. Клетки и дебрис удаляют центрифугированием (15 мин при 500 g).
Бесклеточную надосадочную жидкость хранят в замороженном виде или при 4°С после добавления азида натри» [1/100 объема 10%-ного (вес/объем) исходного раствора NaN3], При очистке IgM-антител высаливанием сразу же добавляют
7,3 г сульфата аммония на 25 мл надосадочной жидкости (50%-ное насыщение). После добавления соли раствор держат на холоду до образования преципитата, после чего проводят дальнейшие процедуры.
Г. Эффективность мечения
Эффективность мечения варьирует у разных линий гибридом в значительной степени. Ее легко оценить, измеряя активность кислотонерастворимой фракции после обработки небольшой порции надосадочной жидкости трихлоруксусной кислотой (ТХУ).
Некоторые линии включают более 75% добавленного 3Н-лей-
Типирование тканей
221
цина, другие — не более 35%, после чего клетки начинают гибнуть от «перенаселения». Доля метки, включаемой в антитела, зависит также от скорости синтеза антител конкретных линий и от того, образуются ли цепи иммуноглобулинов миеломноп> происхождения. Для ряда линий эффективность включения метки в антитела варьирует от 5 до 24% вводимой в среду метки.
III. ОЧИСТКА АНТИТЕЛ
Для того чтобы тест связывания с антителами был эффективным, а фон неспецифического связывания.—низким, необходимы чистые препараты меченых антител. Большая часть мышиных IgG связывается с белком А. Эти иммуноглобулины могут быть легко очищены на колонке с иммобилизованным белком А. Получаемые при этом чистые препараты антител характеризуются очень низким уровнем неспецифического связывания. Мышиные IgM и крысиные иммуноглобулины проще всего высаливать,, однако получаемые при этом препараты содержат примеси.
А. Очистка на колонке с белком А
1. Буферные растворы
ГСР (гемагглютинационный солевой раствор): 8 г NaCl;
2,4 г Na2HP04-2H20; 0,9 г NaH2P04-H20; 0,8 г NaN3-H20 до-1000 мл (pH довести до 7,2). В состав этого раствора входят также 0,1 М цитрат натрия, pH 6,0; 0,3 М глицин-НС1, pH 3,0;.
0,5 М глицин-HCl, pH 3,0; 1,0 М трис, pH 9,0.
2. Колонка
Небольшая колонка, содержащая 3 г матрицы белок А — сефароза (Pharmacia, Швеция), способна связать антитела, синтезируемые 20—40-106 клетками. При условии правильного обращения она может храниться в течение нескольких лет и использоваться многократно. Удобно, но не обязательно использовать предлагаемую фирмой Pharmacia колонку К9/15 с резервуаром R9. Колонку можно обрезать на половину длины, чтобы ее объем соответствовал объему матрицы.
Сефарозу с иммобилизованным белком А заливают ГСР, дают набухнуть, дегазируют и помещают в колонку. После оседания матрицу промывают несколькими объемами ГСР, затем' кислым элюентом (см. ниже), нейтрализующим раствором и. снова ГСР перед первым циклом использования. Между циклами набитую колонку можно хранить с ГСР.
-222 Глава 12
-1,0
о
о
-0,5
0
Проскок 1 5 10 15 20 25 30 35 40
Номер фракции
.Рис. 12-1. Очистка меченных 3Н-лейцином антител на колонке с иммобилизованным белком А. Клетки гибридомы 3-83Р секретируют антитела с тяжелой цепью у2а и легкой цепью и. Эти антитела сильно связываются с Н-2к, слабо связываются с Н-2Ь и не связываются с H-2d (Ozato et al., 1980a). 15-106 клеток инкубировали в течение 24 ч в 16 мл среды для мечения (разд. П.БиВ). Бесклеточную культуральную жидкость пропускали через колонку с иммобилизованным белком А (разд. III,А,в). Проскок собирали в одну пробирку, а элюат — фракциями по 1 мл. Исследовали связывающую активность фракций (разд. V,2) по взаимодействию с 3-106 клетками соответствующих Н-2-ти-пов. Специфически связывается с клетками при низком фоне только материал, элюируемый с колонки при pH 4,5.
