Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Б. Альтернативные методы
Существует много вариантов детектирования антигенов клеточных поверхностей за счет связывания специфических антител. Ряд этих методов описан в первой книге из серии, редактируемой И. Лефковитсом и Б. Пернисом, «Immunological Methods»1 ¦(Fathman, 1979; Forni, 1979; Johnson, 1979; Stocker, Bernoco, 1979); здесь мы коснемся лишь наиболее распространенных из них.
Чаще других используют метод, основанный на комплемент-зависимом лизисе клеток. Этот метод прост и не требует дорогостоящих реактивов, а его микровариант можно проводить с очень малым числом клеток. Основным недостатком метода является то, что его можно использовать только с комплемент-связывающими антителами, а также то, что необходимо присутствие «магического» ингредиента, каким является «хороший» жомплемент, и живых клеток-мишеней, свободных от побочных
Имеется русский перевод: Методы исследований в иммунологии, М.,
¦«Мир», 1981.
218 Глава 12
аутоантител. К недостаткам относится также необходимость оценки результатов с помощью микроскопа, если не применяется метод освобождения 51Сг.
Флуорохромы можно присоединять непосредственно к моноклональным антителам, или, как это делается чаще всего, можно пометить вторичный реагент для непрямого выявления антител, такой, например, как белок А из Staphylococcus aureus или антитела против иммуноглобулинов. Флуоресцентное окрашивание дает существенную информацию о распределении антигена в смешанных клеточных популяциях, однако наблюдения в микроскоп занимают много времени и их интерпретация не всегда объективна. К тому же флуоресцентный клеточный сор-тер не всегда доступен, и работа на нем обычно требует предварительных заявок и планирования.
Для того чтобы получить радиоактивно меченные антитела, обычно используют 1251. Следует иметь в виду, что некоторые моноклональные антитела при иодировании теряют связывающую активность (если у них в связывающем центре содержится тирозин). Вместе с тем высокая удельная активность и удобство использования гамма-счетчиков при применении 1251 заставляют примириться с коротким периодом полураспада изотопа!. Если анализируется большое число разных антител, то выгодней метить вторичный реагент для их непрямого выявления. Правда, белок А можно использовать только для некоторых классов антител, а антитела против иммуноглобулинов не всегда могут применяться при работе с В-клетками.
Если гибридомная линия, синтезирующая необходимые моноклональные антитела, отсутствует, то приходится использовать один из перечисленных выше методов мечения антител. Однако и в этом случае можно в дальнейшем предусмотреть биосинтетическое введение метки в антииммуноглобулиновые моноклональные антитела, поскольку их можно использовать вместо иодированных реагентов.
II. БИОСИНТЕТИЧЕСКОЕ МЕЧЕНИЕ
А. Выбор аминокислот и радиоактивного изотопа
В принципе можно использовать любую меченную радиоактивным изотопом аминокислоту, которая включается в белки с достаточной эффективностью. Мы, например, предпочитаем 3Н-лейцин. Лейцин является необходимой аминокислотой, в достаточной степени представленной в иммуноглобулинах. Кроме того, среды, не содержащие лейцина, имеются в продаже. Тритий стоит дешевле, чем 14С, и может быть получен с большей удельной активностью. Различие в периодах полураспада между
Типирование тканей
219
этими изотопами в данном случае не имеет существенного значения, так как эти периоды превышают продолжительность обычного пребывания исследователей на академических должностях. 14С может иметь преимущества тогда, когда встречаются осложнения, связанные с тушением люминесценции. Если требуется очень высокая удельная активность, то применяют 35S-Me-тионин, однако при этом необходимо чаще получать и очищать меченые антитела и использовать их в более короткие сроки.
Приведенный здесь метод с применением 3Н-лейцина может быть использован при работе с любой меченой аминокислотой (или смесью аминокислот). При этом нужна только культуральная среда, не содержащая соответствующей аминокислоты (или аминокислот). Такие среды легко готовить, используя Select-Amine Kit (Gibco).
Б. Среды
Приведенные здесь прописи в основном взяты из работы Фазекаша де Сент-Грота и Шайдеггера (Fazekas de St. Groth, Scheidegger, 1980). Все среды следует готовить в стерильных условиях из реактивов аналитической степени чистоты (analytical grade).
1. Глюкоза-калийнатриевый буфер (ГКН-буфер)
В состав буфера входят: 8 г NaCl; 1,78 г Na2HP04-2H20;
0,69 г ЫаН2Р04-Нг0; 0,4 г КС1; 2 г глюкозы; 0,01 г фенолового красного; Н20 до 1000 мл, pH 7,2.
Буфер стерилизуют автоклавированием (15 мин при 115°С) и хранят при комнатной температуре.
2. Концентрированная среда
500 мл безлейциновой среды МСИ (модифицированная среда Игла; Gibco, номер по каталогу 320-1895); 11,1 мл 10%-ной
{вес/объем) глюкозы; 5,6 мл 20%-ного бычьего сывороточного альбумина (БСА; фракция V, порошок, Sigma, номер по каталогу А-4503) в сбалансированном солевом растворе.
