Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
4. Нанесение ISO-гелей на пластины для DALT-разделения
Флаконы с ISO-гелями достают из холодильника, где он» хранились при —70°С. После того как их содержимое оттает, его выливают на сито (используют ситечко для чая) для того, чтобы стекла жидкость. Столбик геля помещают в штатив для загрузки кассет, располагая так, чтобы его конец, соответствующий кислым значениям pH, находился слева. Грубо обрезанный (бритвой) конец столбика соответствует кислым значениям pH, а ровный, сглаженный — основным.
DALT-кассету с гелем помещают в загрузочный штатив таким образом, чтобы метка оказалась в правом нижнем углу. Столбик ISO-геля скатывают в щель DALT-кассеты и расправляют с помощью шпателя; избыток жидкости удаляют и заливают гель агарозой (разд. II, Б, 14).
5. DAL Т -электрофорез
Кассеты с гелем вставляют в щели шаблона резервуара для электрофореза (DALT-резервуар). Столбики ISO-геля, залитые агарозой, находятся теперь слева. После того как вставлены все 20 кассет, проверяют уровень буфера, который не должен быть ниже их верхней кромки. Затем закрывают крышку, подсоединяют электроды и включают источник питания. Устанавливают напряжение 160 В и электрофорез проводят в течение ночи до тех пор, пока краситель (свидетель) не достигнет правого края кассет, который на самом деле является нижней частью геля. Следует также проверять работу насосов и охлаждающей системы.
Перед извлечением кассет с гелем отключают источник тока и отсоединяют электроды. Кассеты извлекают с осторожностью (они скользкие) и помещают на штатив. Стекла разъединяют тефлоновым «ножом». Гели снимают со стекла и помещают в пластмассовую кювету, содержащую 20%-ный этанол и 5%-ную уксусную кислоту (в случае радиоавтографии) или ДМСО (в случае радиофлюорографии).
14*
212 Глава 11
Д. Радиоавтография и радиофлюорография
1. Радиоавтография
а. Обработка гелей. После инкубации в течение 1 ч в растворе 20%-ного этанола и 5%-ной уксусной кислоты (примерно 200 мл раствора на гель) гели промывают 4 раза по 20 мин 20%-ным этанолом. К последней порции 20%-ного этанола добавляют 2% глицерола и через 20 мин гели помещают в аппарат для высушивания гелей.
б. Высушивание гелей. Выдвижной отсек полностью выдвигают вперед и откидывают накладку из силиконовой резины. Каждый гель помещают на лист фильтровальной бумаги Whatman № 3 (два геля рядом на листе размером 19X39 см) и накрывают пленкой Saran. Этот «сэндвич» помещают в аппарат, накрывают накладкой, подсоединяют аппарат к предварительно включенному вакуумному насосу и на 3 ч через таймер включают нагревательный элемент, отрегулированный на температуру 50 °С. Через 3—5 ч насос отключают и гель вынимают из аппарата. Гели остаются на подложке из фильтровальной бумаги.
в. Экспонирование пленки. Гели приводят в контакт с пленкой XAR-5 (Kodak) в пластмассовой фотокассете и помещают для экспонирования на полку камеры для радиоавтографии (разд. II, А, 12). К воздушным подушкам подается сжатый воздух для того, чтобы гели полно контактировали с пленкой. После экспонирования в течение соответствующего времени пленку проявляют в автомате для проявления пленок X-Omat (Kodak) (разд. II, А, 17).
2. Радиофлюорография
а. Обработка гелей. После электрофореза гели погружают в ДМСО (150 мл на гель) и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Эту процедуру повторяют, перенося гели в кювету со свежим раствором ДМСО. Затем гели пропитывают в течение 2—3 ч в растворе 2,5-дифенилоксазола [13%-ный раствор (вес/объем) в ДМСО], промывают 45 мин в деионизованной воде, выдерживают 15 мин в 2%-ном глицероле и, наконец, помещают в аппарат для высушивания.
б. Высушивание гелей. Эту стадию проводят, как описано в предыдущем разделе.
в. Экспонирование пленки. Гели помещают в металлические кассеты (Kodak), где они контактируют с пленкой XAR-5 (Kodak). Кассеты запечатывают в герметическую упаковку STERIL-РАСК» для предохранения от влаги и помещают в хо-
Использование системы 1SODALT
213
лодильник при —70 °С. После экспонирования в течение необходимого времени кассету вынимают, дают ей согреться до комнатной температуры в запечатанном виде, вынимают пленку и проявляют ее в автомате для проявления пленок X-Omat (Kodak) (разд. II, А, 17).
IV. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
А. Чувствительность
Чувствительность детектирования при использовании для анализа описанной выше методики можо оценить с помощью двух параметров. Первый параметр представляет собой минимальное содержание белка в образце, при котором этот конкретный белок может быть выявлен в виде пятна. Второй — это минимальное число клеток (размер клона), которое необходимо для получения полного набора белковых пятен на соответствующих электрофореграммах.
1. Предел чувствительности детектирования
О’Фаррелл (O’Farrell, 1975) установил, что пятно можно обнаружить при экспонировании геля в течение 1 нед (10 000 мин), если в нем присутствует активность 3 расп/мин, сосредоточенная на 1 мм2 геля. Это относится к радиоавтогра-фическому детектированию. Если же учесть усиливающий эффект флюорографии, то можно ожидать 15-кратного увеличения чувствительности методики. В этом случае для образования пятна, вероятно, будет достаточна активность 0,2 расп/мин. По данным наших опытов с лимфоцитарным (За2-белком (П. Робинсон, личное сообщение) установлено, что легко выявляются белки, присутствующие в количестве 104 молекул на клетку. Н-2-Молекулы, присутствующие в клетках в больших количествах, чем (^а2-белок (1—2-105 молекул на клетку), можно выявить с помощью двумерного электрофореза в неочищенных клеточных лизатах. Вместе с тем для аналогичного выявления <За2-молекул необходимо их предварительно осаждение с помощью иммунопреципитации.
