Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
202 Глава 11
8. ДСН-Буфер для DAL Т -разделения
102 г Trizma base (Sigma)
490 г глицина 34 г ДСН
Компоненты растворяют в 34 л воды. Одну порцию буфера используют для двух DALT-разделений.
9. Исходный раствор акриламида для DAL Т -гелей
27% акриламида (Serva)
0,7% N, N'-метиленбисакриламида (Serva)
27% (по объему) глицерола (Serva)
Компоненты перемешивают, раствор фильтруют и хранят •при 4°С. Однократно готовят количество раствора, достаточное на 4—6 нед работы.
10. Буфер для менее плотного
(легкого) компонента градиентных D ALT -гелей
50 г Trizma base (Sigma)
25 г Trizma НС1 (Sigma)
Вода до 1 л
Доводят pH буфера до 8,5 6 н. НС1 и хранят при 4°С.
11. Буфер для более плотного
(тяжелого) компонента градиентных DALT-гелей
100 г Trizma base (Sigma)
50 г Trizma НС1 (Sigma)
Вода до 1 л
Доводят pH буфера до 8,5 6 н. НС1 и хранят при 4°С.
12. Раствор ДСН для DALT-гелей
10%-ный водный раствор ДСН (Serva) хранят при комнатной температуре.
13. ТЕМЭД для ISO - и D ALT -гелей
N, N, N', N'-тетраметилэтнлендиамин (Bio-Rad) хранят при 4°С.
14. Агароза для наслаивания на DAL Т -гели
3 г Trizma base 14,4 г глицина
1 г ДСН
5 г агарозы
Использование системы ISODALT
203
Компоненты растворяют в воде (конечный объем 1 л) и доводят до кипения в микроволновой печи. Агарозу разливают порциями по 50 мл, которые для каждого разделения разогревают в микроволновой печи.
15. Раствор Photo-Flo
1 мл Photo-Flo-200 (Kodak)
670 мл «легкого» буфера (разд. II, Б, 10)
330 мл воды
Раствор предназначен для наслаивания на градиент акри-ламида в ходе полимеризации.
16. Диметилсульфоксид и 2,5-дифенилоксазол для радиофлюорогафии
Концентрированный диметилсульфоксид (ДМСО; Merck) и 13%-ный 2,5-дифенилоксазол (вес/объем) в ДМСО используют для пропитки гелей при радиофлюорографии.
III. МЕТОДЫ
А. Биосинтетическое введение метки
Цель эксперимента — визуализация белков, синтезированных de novo, после включения метки 355-метионина. 355-изотоп имеет высокую удельную активность, и с ним получают лучшие результаты, чем с 14С- или 3Н-изотопами, включенными в аминокислоты.
1. Мечение популяций клеток
Спленоциты, клетки лимфатических узлов или лимфоциты периферической крови культивируют в полной среде RPMI с добавлением 10% сыворотки плода коровы (СПК) при 37°С в присутствии внешних стимуляторов или без них. Для стимуляции клеток используют митогены, лимфокины или антигены.
Применяют конканавалин А (2 мкг/мл), липополисахарид (50 мкг/мл) или лимфокины и антигены в различных концентрациях. В зависимости от стимулирующего агента плотность клеток варьирует от 3-105 до 2-106 клеток/мл. В соответствующий момент времени к клеткам добавляют 355-метионин (20—50 мкКи/мл) и продолжают включать метку в течение 15 ч.
В другом варианте клетки предварительно промывают и метку вводят в среде с низкой концентрацией метионина (кон-
204 Глава 11
центрацию метионина снижают в 20 раз, т. е. она составляет <4 мкг/мл). В этом случае наилучшие результаты получают при продолжительности включения метки 4—6 ч.
2. Активированные Т-клетки
Спленоциты с исходной плотностью 2-106 клеток/мл культивируют в течение ночи в среде RPMI, в которую добавлено 5% СПК, 2 мкг/мл кон-А и 25% фактора роста Т-клеток (ФРТК). После этого клетки центрифугируют, дважды промывают забу-ференным солевым раствором и проводят подсчет живых клеток.
Затем клетки ресуспендируют в свежей среде RPMI, содержащей 1—15 мкг/мл метионина, вводят в среду 25—50 мкКи/мл ^Б-метионина и инкубируют 18—20 ч.
3. Актвированные В-клетки
Спленоциты с исходной плотностью 3-103 клеток/мл культивируют в течение 3 дней в среде RPMI, в которую добавлено 5% СПК, 30 мкг/мл липополисахарида (ЛПС) и 10 мкг/мл декстрансульфата. Затем клетки центрифугируют, дважды промывают забуференным солевым раствором и проводят подсчет живых клеток. После этого клетки ресуспендируют в свежей среде RPMI, содержащей 15 мкг/мл метионина, добавляют 20— 50 мкКи/мл 355-метионина и инкубируют 18—20 ч. Среда с низким содержанием метионина не обеспечивает удовлетворительного включения метки.
4. Клеточные линии
Большинство клеточных линий выдерживает предварительное культивирование в среде без метионина. В результате инкубации 1 • 106 клеток/мл в среде без метионина в течение 6 ч внутренний пул метионина уменьшается, и благодаря этому эффективное включение метки достигается при 4-часовой инкубации клеток с 10—50 мкКи/мл 355-метионина.
5. Клональные культуры
При культивировании в лунках панелей Терасаки (10 мкл) или панелей для микротитрования имеется возможность метить небольшие количества клеток. При этом достигается удовлетворительная эффективность мечения. Нам удалось ввести метку в клон Т-клеток, в котором насчитывалось всего 300 клеток, но мы не смогли пометить клоны В-клеток.
Использование системы I SOD ALT
