Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Shulman М., Wilde D„ Kohler G. (1978). Nature (London), 276, 269.
Subbarao B., Mosier D. (1982). Immunol. Rev. 69, 81.
Yakura H„ Shen F. W., Bourset E., Boyse E. A. (1983). J. Exp. Med., 157, 1077.
Глава 11
Использование системы ISODALT двумерного этектрофореза для анализа большого числа образцов
И. Лефковитс, П. Янг, Л. Кюн, Дж. Кеттмэн,
А. Джеммелл, С. Толлаксен, Л. Андерсон, Н. Андерсон
I. НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА
О'Фаррел (O’Farrell, 1975) предложил аналитический метод для анализа сложных смесей белков с использованием комбинации двух вариантов разделения — по заряду и по размеру.
Андерсон и Андерсон (Anderson, Anderson, 1978) разработали его модифицированный вариант, позволяющий проводить одновременное разделение большого числа образцов. Они увеличили масштабы разделения, автоматизировали и усовершенствовали методические приемы. Электрофореграммы, получаемые этим методом, дают возможность сопоставлять картины фракционирования многих белков (обычно одновременно анализируется 20 образцов). Конечная цель этого метода — сравнение полученных электрофореграмм с помощью компьютера, который не только сопоставляет две картины путем наложения, растягивания и коррекции, но и выявляет наличие или отсутствие отдельных белковых пятен (или групп пятен) при сравнении с накопленными в его памяти экспериментальными данными.
В Аргоннской национальной лаборатории (Argonne, США) система ISODALT (в аббревиатуре ISO относится к разделению по заряду, DALT —к разделению по размерам) широко используется для решения разнообразных задач. В этой главе описан один из вариантов системы ISODALT, который используется в Базельском институте иммунологии для исследования ряда проблем.
II. МАТЕРИАЛЫ
А. Оборудование
Все описанные здесь приспособления и аппараты были изготовлены в Базельском институте иммунологии в соответствии с рабочими инструкциями национальной лаборатории г. Аргонн.
Использование системы ISODALT
193
Рис. 11-1. Прибор для изоэлектрофокусирования, в котором производится разделение в первом направлении 20 образцов.
1. Аппарат для изоэлектрофокусирования
Аппарат (рис. 11-1) состс|йт из 20 трубок длиной 19 см с внутренним диаметром 1,5 мм, вмонтированных в стойку из плексигласа, и камеры, в которую заливают 200 мл основного электролита. Стойка с трубками приспособлена для того, чтобы ее погружать в емкость, содержащую ~2 л кислого электролита. Один платиновый электрод находится в плексигласовой емкости аппарата, а второй — в стойке, поддерживающей гели.
2. Тефлоновый моечный сосуд
На рис. 11-2 показан тефлоновый сосуд с полостью, в которую вставляется блок трубок аппарата для изоэлектрофокусирования при промывке их хромовой кислотой.
13—1278
194 Глава 11
Рис. 11-2. Тефлоновый сосуд с хромовой кислотой, в которую погружен блок трубок прибора для изоэлектрофокусирования.
3. Источник тока для изоэлектрофокусирования
Используется источник тока модели 2103 (LKB), работающий в диапазоне 0—20 мА.
4. DALT-резервуар для разделения по размеру
Резервуар, сделанный из плексигласовых пластин толщиной около 2,5 см (рис. 11-3), имеет длину 76 см, ширину 34 см и высоту 28 см (наружные размеры). В резервуар вмещается 35 л буфера с ДСН. За счет вставляющихся перегородок резервуар разделяется на две электродные и центральную камеры. Крышка соединена с резервуаром таким образом, что его нельзя открыть, если он подсоединен к источнику питания. На дне резервуара находится охлаждающий змеевик, подсоединенный к мощному холодильному термостату (Forma Scientific, модель 2166), который регулируют так, чтобы температура буфера была 6—8°С. Циркуляция буфера обеспечивается тремя насосами (по одному на каждую из двух электродных камер и один на центральную камеру).
Использование системы I SOD ALT
195
Рис. 11-3. Резервуар для DALT-разделения во втором направлении на 20 пластинах полиакриламидного геля.
5. Источник тока для DAL Т -разделения по размерам молекул
Используют источник тока модели 6448 В (Hewlett-Packard), работающий в диапазоне 0—1,8 А.
6. Кассеты для заливки гелей
Кассета для заливки гелей представляет собой два скрепленных друг с другом стекла размером 17X17 см (толщина стекол 2,8 мм). На одно из стекол наклеены спейсеры. Стекла скрепляются полосой силиконовой резины, так что кассета
13*
196 Глава 11
Рис. 11-4. Емкость для одновременной заливки 22 кассет (20+2 резервные) акриламидной смесью. Емкость может быть использована и для приготовления градиентных гелей.
раскрывается, как книжка. «Закрытая книжка» образует камеру объемом 60 см3. Кассеты сделаны в мастерских Ф. А. Джиером (Лейк-Блафф, США).
7. Емкость для заливки кассет
I
Емкость для заливки кассет, в которую можно поместить 22 плотноуложенные кассеты, показана на рис. 11-4. Передняя стенка заливочной емкости съемная, она фиксируется в данном положении винтами. С одной стороны емкости находится W-об-разная камера, с помощью которой обеспечивается плавный ввод акриламидной смеси при заливке. На дне заливочной емкости находится плексигласовый вкладыш со сточенной наискось кромкой, который помогает беспрепятственно поступать акриламидной смеси ко всем кассетам. Заднюю стенку заливочной емкости крепят к поворачивающейся части специального штатива для того, чтобы во время поступления акриламидной смеси емкость можно было перевести в наклонное положение. В задней части заливочной емкости располагается специально сделанная в мастерских института надувная резиновая подушка, прижимающая кассеты друг к другу.
