Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 73

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 239 >> Следующая

Отметим два момента, требующих особого внимания при работе с этой бессывороточной культуральной средой. Во-первых, адаптировать клетки к бессывороточной среде необходимо постепенно, достаточно медленно. Клеточные культуры в средней или в поздней логарифмической фазе растущие на среде, содержащей сыворотку, следует разводить бессывороточной средой в соотношении 1 : 4. Эту процедуру повторяют три раза по мере того, как клетки культуры делятся. Во-вторых, необхо-
190 Глава 10
димо избегать как слишком малых, так и слишком больших концентраций клеток. В бессывороточной среде многие клеточные линии не способны расти при тех минимальных плотностях, которые достижимы для сред с сывороткой. Жизнеспособность клеток в этой среде снижается также при высоких плотностях клеточных популяций (>106 клеток/мл).
Время удвоения в бессывороточной среде может изменяться, но соответствующие эффекты не всегда предсказуемы. Большинство клеточных линий замедляет темп делений, но в ряде случаев наблюдается ускорение деления клеток. Эти изменения не являются пагубными, так как все исследованные линии продолжали секретировать большие количества МА (по меньшей мере 5—50 мкг/мл) или интерлейкина. Отмечена также еще одна особенность в характере роста в бессывороточной среде, заключающаяся в том, что клетки перестают прикрепляться к пластмассовой поверхности. В бессывороточной среде клетки большинства линий растут в суспензионной культуре, в то время как добавление сыворотки приводит к образованию клеточных монослоев.
Культуральную жидкость гибридов собирают, когда погибнет около 80% клеток. Объединяют вместе несколько культур объемом 200 мл и клеточный дебрис отделяют либо фильтрованием, либо центрифугированием при 1000 g 15 мин. После этого к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония из расчета 350—400 г/л. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке 1 ч при 4°С и затем еще инкубируют 18—24 ч при 4°С без встряхивания. В результате практически весь преципи-тированный материал оседает на дне. Осторожно удаляют >80% надосадочной жидкости, а оставшуюся взвесь центрифугируют при 5000 g 30 мин для осаждения фракции, содержащей иммуноглобулины. Осадок ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР или ЗБР и диализуют против избытка того или другого буфера. Предпочтительнее использовать ЗБР, так как при этом существенно снижается опасность бактериального роста. После хроматографии на носителе Sephacryl S-200 (для выделения IgG) или Sephacryl S-300 (для выделения IgM) получают МА 95%-ной чистоты.
1. Модифицированную Исковом среду МСИД (МСИДИ) разводят из порошка (Gibco) по прописи для 5 л без добавления бикарбоната натрия или ГЭПЭС в объеме около 3,5 л трижды дистиллированной воды.
2. Добавляют 50 мл 200 мМ L-глутамина (Gibco, номер по каталогу 043-5030).
3. Добавляют 50 мл смеси аминокислот (поставляется в виде концентрата 100Х фирмой Gibco; номер по каталогу 043-1140).
Картирование новых антигенов В-лимфоцитов
191
4. Добавляют 50 мл 100 мМ пирувата натрия (Gibco, номер по каталогу 043-1360).
5. Добавляют 18,5 г ЫаНгС03.
6. Добавляют 5 мл 5-10-2 М р-меркаптоэтанола.
7. Добавляют 50 мл раствора пенициллина и стрептомицина (5000 ед/мл).
8. Добавляют 175 мг трансферрина (трансферрин человека, Sigma, США, номер по каталогу Т-2252).
9. Добавляют 25 мг инсулина (бычий инсулин, Sigma, США, номер по каталогу 1-5500).
10. Добавляют 1 мл 1 М этаноламина (Fluka, номер по каталогу 02400).
11. Добавляют 0,7 мл разведенного в 1000 раз исходного раствора селенита натрия (DIFCO, США). Исходный раствор готовят, растворяя 17,3 мг селенита натрия в 100 мл НгО, стерилизуют фильтрованием и хранят при 4°С.
После того как все реагенты растворяются (обычно это занимает не более 2 мин), доводят полный объем среды до 5 л трижды дистиллированной водой и стерилизуют среду фильтрованием через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Среда, приготовленная описанным способом, стабильна не менее 1 мес при хранении в темноте при 4°С.
Рекомендуемая литература
Loketi М. R., Stall А. М. (1982). J. Immunol. Methods, 50, R85.
Литература
Fazekas de St. Groth S., Scheidegger D. (1980). J. Immunol. Methods, 32, 297. Fraker P. J., Speck J. C. (1978). Biochem. Biophys. Res. Commun., 80, 849. Iscove N. N., Melchers F. (1978). J. Exp. Med., 147, 923.
Kohler G. (1981). In: Immunological Methods (I. Lefkovits and B. Parnis, eds.), Vol. 2, p. 285. Academic Press, New York.
McKearn J. P., Rosenberg N. (1985). Eur. J. Immunol., 15, 295.
McKearn I. P., Baum C. W„ Davie J. M. (1984). J. Immunol., 132, 332.
Meuer S. C., Hussey R. E., Fabbi М., Fox D., Acuto O., Fitzgerald K., Hodg-don J. C., Protentis G. P., Schlossman, S. F., Reinherz E. L. (1984). Cell, 36, 897.
Murakami H., Masui H., Sato G. H., Sueoka N.. Chow T. P., Kano-Sueoka T.
(1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1158.
O’Farrel P. H. (1975). J. Biol. Chem., 250, 4007.
O’Farr el P. Z., Goodman H. M„ O’Farrel P. H. (1977). Cell, 12, 1132.
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed