Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Теперь, когда мы обсудили некоторые технические проблемы и подходы к их решению, можно перейти к описанию методик, которые были с успехом использованы при проведении упомянутых выше процедур анализа.
Б. Иммунизация и слияние
1. Взрослым крысам-самкам внутривенно вводят 107 живых клеток лимфомы в 5 мл ЗФР. Клетки получают из культур в середине логарифмической фазы роста. При этом плотность клеток обычно составляет 1—2-105 клеток/мл.
2. Через три или четыре дня у крыс удаляют (в стерильных условиях) селезенки и каждую из них рассматривают в качестве индивидуального объекта исследования. Крысы существенно различаются по ответу на антигены лимфом, поэтому не следует смешивать клетки от сильно отвечающего животного с клетками от слабо реагирующей особи, так как это ведет к уменьшению содержания нужных клеток. Селезенки диспергируют до отдельных клеток и суспензию отфильтровывают через пастеровскую пипетку, заполненную рыхло упакованным кусоч-
Картирование новых антигенов В-лимфоцитов
181
ком ваты. Полученную суспензию промывают (в конической пробирке на 50 мл) избытком сбалансированного солевого раствора, содержащего глюкозу (CP/глюкозой), с помощью центрифугирования при 250 g в течение 5 мин. Супернатант удаляют, клетки вновь суспендируют в 15 мл 0,017 М триса, 0,14 М хлористого аммония, pH 7,2, для того чтобы лизировать эритроциты, и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Добавляют 35 мл CP/глюкозы и еще два раза промывают клетки, затем их ресуспендируют примерно в 5 мл СР/глюкозы и подсчитывают жизнеспособные клетки (которых должно быть >80%) в 0,1%-ном трипановом синем.
3. Смешивают 108 жизнеспособных клеток селезенок крыс с 5-107 жизнеспособных клеток миеломы линии Sp2/0-Agl4 или FO, полученных из культур в логарифмической фазе роста и предварительно отмытых 3 раза CP/глюкозой для удаления сыворотки. Общий объем клеток селезенки и миеломных клеток не должен превышать 10 мл. Лучше всего использовать объемы от 5 до 10 мл, так как при больших объемах имеет место эффект расслоения клеток по плотности, приводящий к отделению более крупных миеломных клеток от спленоцитов. Образец объемом 5—10 мл центрифугируют в конической пробирке на 50 мл при 250 g 5 мин и удаляют супернатант.
4. К клеткам добавляют по каплям 1 мл 50%-ного ПЭГ 4000, pH 7,2—7,4, подогретого до 37 °С. В ходе добавления ПЭГ клеточную суспензию постоянно перемешивают. После 60 с инкубации с ПЭГ медленно добавляют 20 мл СР/глюкозы, подогретой до 37 °С. Смесь инкубируют 2 мин, а затем добавляют 30 мл СР/глюкозы и центрифугируют при 250 g 5 мин.
5. После центрифугирования супернатант удаляют, а клеточный осадок осторожно ресуспендируют в 5—10 мл полной культуральной среды, содержащей сыворотку плода коровы (СПК). Мы обычно используем минимальную среду Игла (МСИ), модифицированную Дульбекко (МСИД; McKearn et al., 1984), с добавлением сыворотки, однако применение среды RPMI-1640 также дает хорошие результаты. Далее мы будем называть полную среду для гибридов средой МСИД. После слияния определяют число жизнеспособных клеток, которое является показателем эффективности методики (обычно выход >70—80% живых клеток).
6. Клетки ресуспендируют до плотности 2-106 жизнеспособных клеток в 1 мл и всю суспензию вносят в плоскодонные лунки 96-луночных панелей по 100 мкл на лунку. Инкубируют культуру при 37°С в СОг-инкубаторе при влажности >90%.
7. Через 24—48 ч в лунки добавляют по 100 мкл селективной среды [среда МСИД с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (ГАТ)] (Kohler, 1981). Культуры выдерживают в
182 Глава 10
среде МСИД-ГАТ 2 нед, подкармливая клетки через каждые 5 дней (при этом из лунки удаляют 100 мкл среды и добавляют туда 100 мкл свежей среды МСИД-ГАТ). Затем переводят клетки из селективной среды МСИД-ГАТ в среду МСИД с гипоксантином и тимидином (МСИД-ГТ). Через 4 нед после слияния клетки можно вести на среде МСИД.
8. Клоны с гибридными клетками в лунках можно увидеть через 14—18 или даже через 28 дней после слияния. После того как зарегистрировано образование клонов, можно отбирать из лунок образцы надосадочной жидкости. Для проведения одного теста связывания нужно 25 мкл культуральной жидкости. Обычно готовят все необходимое для одновременного скрининга 100—200 образцов. Надосадочные жидкости из лунок с быстро растущими клонами обычно тестируют через 18 дней, а из лунок с более медленно растущими клонами — через 21—28 дней после слияния.
В. Отбор позитивных гибридных клонов
1. В лунки конической формы 96-луночной полистирольной панели вносят по 25 мкл не содержащей клеток культуральной среды от каждой культуры гибридов. В одну контрольную лунку помещают чистую культуральную среду, а в другую—культуральную среду с крысиными МА, не обладающими связывающей активностью по отношению к клеткам лимфомы, использовавшимися для иммунизации. При постановке негативных контролей мы использовали крысиные МА против антигенов главного локуса гистосовместимости (МНС) крыс и крысиные антигаптеновые МА, относящиеся ко всем основным изотипам иммуноглобулинов. В третьей контрольной лунке должны находиться крысиные МА, связывающиеся с клетками-мишенями, т. е. с клетками лимфомы.
