Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Обнаружение гликолипидных антигенов
171
Д. Химическое окрашивание
Пластину для ВЭТСХ с алюминиевой или, что предпочтительнее, стеклянной подложкой размечают карандашом; образцы (минимальное количество 1 мкг) наносят на пластину, как описано выше. После хроматографии и высушивания пластину подвергают действию паров иода в течение 5 мин. При этой обработке все нейтральные липиды, фосфолипиды и гликолипиды окрашиваются в цвета от желтого до темно-коричневого. Приобретаемая окраска нестабильна. Хроматограмму можно также опрыскать под тягой реагентом А, высушить и опрыскать реагентом Б. При нагревании хроматограммы при 100 °С в течение 5 мин развивается окраска от розовой до пурпурной. Этот метод окрашивания весьма чувствителен; при его использовании выявляются все углеводы. Ганглизоиды, содержащие сиа-ловую кислоту, окрашиваются в голубой цвет, после того как опрысканную реагентом В хроматограмму выдерживают 5 мин при 110°С. При нагревании хроматограмму следует накрыть стеклянной пластиной, для того чтобы соляная кислота не испарилась полностью. Нейтральные гликолипиды окрашиваются этим реагентом в светло-серый цвет.
VII. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
Описанный в разд. IV твердофазный РИА является очень чувствительной и удобной методикой определения липидных антигенов. Как уже было отмечено, некоторые антитела в условиях, при которых проводят эксперимент, имеют тенденцию к неспецифическому связыванию с твердофазным носителем, поэтому при первичных тестах следует использовать в качестве контроля носитель, не покрытый липидом. Это удваивает объем работы при скрининге супернатантов гибридом на связывание с липидными антигенами.
Если антиген в липидном экстракте составляет только минорную фракцию, то при твердофазном РИА можно получить ложноотрицательный результат. В этом случае антиген может быть маскирован фосфолипидами и нейтральными липидами, особенно если образец загрязнен липидами из нижней фазы хлороформ-метанольного экстракта.
При использовании ТСХ, когда сначала разделяются компоненты липидного экстракта и только после этого они выявляются антителами, устраняется влияние других липидов. Этот метод является, таким образом, более надежным и чувствительным, чем твердофазный РИА в микротитрационных панелях. Однако он требует больших затрат времени, большего расхода антител и для получения хороших радиоавтограмм этим мето-
172 Глава 9
дом необходим определенный навык. Кроме того, при использовании этого метода для каждого типа тестируемых моноклональных антител необходимо подбирать индивидуальные оптимальные условия. По всем этим причинам метод ТСХ с последующим иммунным проявлением и радиоавтографией не пригоден для скрининга большого набора антител.
Литература
Brockhaus М., Magnani J. L., Blaszczyk М., Steplewski Z„ Koprowski H., Karls-son K--A., Larson G., Ginsburg V. (1981). J. Biol. Chem., 256, 13223— 13225.
Folch G., Lees M, Sloane Stanley G. H. (1957). J. Biol. Chem., 226, 497—509.
Fraker P. L., Speck J. C. (1978). Biochem. Biophys. Res. Commun., 80, 849— 857.
Fukushi Y., Hakomori S., Nudelman E., Cochran N. A. (1984). J. Biol. Chem., 259, 4681—4685.
Huang L. C., Civin С. I., Magnani J. L., Shaper J. H., Ginsburg V. (1983). Blood, 61, 1020—1023.
Kflnnagi R., Stroup R., Cochran N. A., Urdal D. L., Young W. U7., Hakomori S. (1983). Cancer. Res., 43, 4997—5005.
Kobata A. (1972). In: Methods in Enzymology (V. Ginsburg, ed.), Vol. 28, pp. 262—271. Academic Press, New York.
Ladish S., Gillard B. (1983). Proc. Int. Symp. Glycoconjugates, 7th, Lund, Sweden.
Magnani J. L., Smith D. F., Ginsburg V. (1980). Anal. Biochem., 109, 399— 402.
Magnani G. L„ Nilsson B., Brockhaus М., Zopf D., Steplewski Z., Koprowski H., Ginsburg V. (1982). J. Biol. Chem., 257, 14365—14369.
Pukel C. S., Lloyd К. O., Travassos L. R„ Dippold W. G., Oettgen H. F., Old L.J. (1982). J. Exp. Med, 155, 1133—1147.
Schacht J. (1981). In: Methods in Enzymology (M. Lowenstein ed.), Vol. 72, pp. 626—631.
Smith D. F., Magnani J. L., Ginsburg V. (1981). Arch. Biochem. Biophys., 209,52.
Svennerholm L., Fredman P. (1980). Biochim. Biophys. Acta, 617, 97—109.
Towbin H., Schoenenberger C., Ball R., Braun D. G., Rosenfelder G. (1984). J. Immunol. Methods, 72, 471—479.
Yamashita K., Mitsuoki Т., Kobata A. (1982). In: Methods in Enzymology (V. Ginsburg, ed.), Vol. 83, pp. 105—126. Academic Press, New York.
Zemmour J., Portoukalian J., Dore J. F. (1984). J. Immunol. Methods, 66, 331— 340.
Глава 10
Картирование новых дифференцировочных антигенов В-лимфоцитов
Дж. Мак-Керн, Дж. Хансон
I. ВВЕДЕНИЕ
Известно, что клетка млекопитающих способна синтезировать ориентировочно 3-104 различных белков и экспрессировать до 5-103 этих белковых молекул на плазматической мембране в любой момент времени. Совершенно очевидно, что наши представления о биологии мембран лимфоцитов далеко не полны. Это особенно четко видно на примере исследования связей между мембранными структурами и их функциями. Например, в предпринятых недавно попытках создать каталог компонентов мембран выявилось большое число молекул с неизвестной функцией, так называемых молекул-«сирот». Эти молекулы были идентифицированы при использовании некоторых схем очистки, но их функциональная роль остается неясной. Обычно при иммунопреципитации с использованием моноклональных антител (МА) против целых клеток или мембранных везикул выявляется новая детерминанта, и после этого соответствующие МА пытаются использовать в качестве индукторов или ингибиторов в каком-либо тесте функциональной активности лимфоцитов. Модулируемые МА проявления активности лимфоцитов позволили выяснить связь некоторых неисследованных ранее компонентов плазматических мембран с физиологическими процессами. Примерами таких компонентов мембран могут служить молекула Lyb 2 (Subbarao, Mosier, 1982), семейство высокомолекулярных гликопротеинов Ly5 (Yakura et al., 1983) и Tll-ре-цептор (эритроцитарный) (Meuer et al., 1984). Однако функции большинства охарактеризованных к настоящему времени мембранных компонентов остаются неизвестными.
