Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 64

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 58 59 60 61 62 63 < 64 > 65 66 67 68 69 70 .. 239 >> Следующая

Наилучшие результаты мы получили на алюминиевых пластинах для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Merck, Darmstadt, ФРГ), покрытых силикагелем 60. Импрегнирование тонкослойной хроматограммы небольшим количеством полимера полиизобутилметакрилата увеличивает прочность слоя силикагеля (Brockhaus et al., 1981). Эта обработка придает силикагелю водоотталкивающие свойства и в целом приводит к снижению фона и повышению чувствительности при использовании многих, но не всех типов моноклональных антител. Некоторые антитела неспецифически связываются с
Рис. 9-3. Радиоавтограф тонкослойной хроматограммы после инкубации с моноклональным» антителами 29 и меченными ,251 козьими антителами против IgM мыши. Дорожки а, б, в и г соответствуют глнколнпидам, экстрагированным из эритроцитов человека (по 100 мкл от разных доноров). Дорожка д — 200 нг очищенного гликолипида ЛНФП III (лакто-Ы-фукопентозил-Ш-церами-да). Цифрами обозначены положения стандартов, содержащих от одного до пяти остатков сахара: 1 — моногексозидцерамида, 2 — дигексозидцерамида, 3 — тригексозидцерамида, 4 — глобозида и 5 — гликолипида ЛНФП III. Основным гликолнпидом человеческих эритроцитов является глобозид, который должен присутствовать в положении, соответствующем стандарту 4. Этот гликолипид не выявляется с помощью данных моноклональных антител. Обращает на себя внимание то, что узнаваемая антителами антигенная детерминанта присутствует во многих высокомолекулярных гликолипидах и что гетерогенность этих липидов для эритроцитов разных доноров невелика. Дублеты полос образуются из-за различий в лнпиднон части молекул.
Обнаружение гликолипидных антигенов
169
пластинами, обработанными таким образом. Поэтому перед использованием следует проверить индивидуально поведение антител на небольших кусочках обработанных и необработанных пластин и установить, какие пластины наиболее подходящи.
Б. Оборудование
Стеклянный сосуд для ТСХ
Пластины для ВЭТСХ без флуоресцентного индикатора (20X20 см) на алюминиевой подложке (для иммунного окрашивания следует заказывать № 5547) или на стекле (для химического окрашивания следует заказывать № 5631, Merck, ФРГ)
Пластмассовый флакон для промывки Стеклянный эксикатор для обработки парами иода Микрошприц (10 мкл)
Контейнер из оргстекла (для использования в качестве влажной камеры) размером 20X20 см Парафильм Сушильный шкаф
Рентгеновская пленка XS-5 (Kodak) или аналогичная ей Качалка
В. Реактивы
Проявляющий1) раствор: хлороформ — метанол — вода (60: :40 : 9, по объему)
Буфер Б: 50 мМ трис-НС1, 100 мМ NaCl, 0,1% азида натрия, 1 % БСА, pH 8,0 ЗФР
Насыщенный раствор полиизобутилметакрилата (Polysciences, США) в н-гексане или н-гептане. Его готовят, растворяя 250 мг гранул полимера в 500 мл кипящего н-гексана или н-геп-тана, нагреваемого в водяной бане при 80 °С в вытяжном шкафу. Следует избегать применения открытого огня! После охлаждения раствор готов к употреблению с момента осаждения мути. Раствор можно использовать многократно Иод (Fluka, Швейцария)
Реагенты для опрыскивания:
Реагент А: 1%-ный солянокислый а-нафтилэтиленди-амин (Fluka, Швейцария) в воде
«Проявляющий» раствор (developing solvent) не имеет отношения к какому-либо процессу проявления. Он перемещается по всей ширине пластины от старта, и за его фронтом происходит хроматографическое разделение липидов. — Прим. ред.
170 Глава 9
Реагент Б: 10%-ный раствор серной кислоты в воде Реагент В: 200 мг резорцинола (Fluka, Швейцария) в 20 мл воды, 80 мл конц. соляной кислоты, 0,25 мл
0,1 М водного раствора сульфата меди Реагенты А и В стабильны при хранении в холодильнике в течение примерно четырех недель.
Г. Обработка антителами
Пластину для ТСХ с алюминиевой подложкой разрезают ножницами на полоски длиной 10 см и различной шириной в зависимости от числа образцов (7 мм на каждый образец и по 15 мм на поля с каждой стороны). Линию нанесения образцов проводят в 15 мм от края пластины мягким карандашом и отмечают точку нанесения для каждого образца. Липиды растворяют в «проявляющем» растворе, образец (1 мкл) набирают в микрошприц и наносят на пластину в виде тонкой полоски. Можно наносить образец на ту же стартовую линию повторно, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить иглой слой силикагеля. После того как место нанесения высохнет, пластину помещают в стеклянный сосуд для ТСХ, в котором содержится 100 мл «проявляющего» раствора, заранее уравновешенного с газообразной фазой. Пластину вынимают до того, как растворитель достигнет ее верхнего края. Полностью сухую пластину погружают на 30 с в полиизобутилметакрилат, растворенный в гексане. Как уже отмечалось выше, эта обработка не является обязательной. Сухую пластину выдерживают в течение 30 мин при 4°С в буфере Б. Пузырьки воздуха, прикрепившиеся к пластине, следует удалить концом пипетки. Пластину вынимают из буфера Б и тыльную сторону тщательно протирают. Затем ее кладут на кусок парафильма, чуть больший по площади, чем сама пластина, и помещают во влажную камеру. Надосадочную жидкость гибридом разводят в соотношении 1: 1 буфером Б и осторожно наслаивают по каплям на хроматограмму (100 мкл на' 1 см2). Влажную камеру устанавливают строго горизонтально. После инкубации в течение 6 ч при 4°С пластину промывают 6 раз по 1 мин охлажденным ЗФР на качалке для удаления избытка антител. Затем инкубацию повторяют в тех же условиях с меченными 1251-антителами (5-106 имп/(мин-мл) против IgG мыши в буфере Б. После инкубации в течение 6—12 ч и отмывки ЗФР в тех же условиях хроматограмму высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой.
Предыдущая << 1 .. 58 59 60 61 62 63 < 64 > 65 66 67 68 69 70 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed