Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
III. ЭКСТРАКЦИЯ ЛИПИДОВ
А. Принцип метода
Большинство методов экстракции липидов основано на процедуре (Folch et al., 1957), позволяющей отделить полярные мембранные липиды от неполярных липидов — холестерола и
Обнаружение гликолипидных антигенов
161
триацилглицеридов. Сначала получают суммарный экстракт с помощью смеси хлороформа и метанола (2:1 по объему), а затем этот экстракт фракционируют, добавляя к нему 20% воды (по объему). Более тяжелую фазу, содержащую в основном неполярные липиды, можно подвергнуть повторной экстракции смесью хлороформ — метанол — вода (3:50:47 по объему). В состав легкой фазы входят ганглиозиды, нейтральные глико-сфинголипиды с более чем тремя остатками сахаров, фосфолипиды, а также следовые количества белков, солей, органических кислот и глюкозы. Ниже описан упрощенный вариант оригинального метода, который позволяет получать препараты липидов, дающие удовлетворительные результаты при твердофазном РИА. Более полный выход ганглиозидов достигается при экстракции смесью хлороформ — метанол (Svennerholm, Fredman, 1980) или смесью диизопропиловый эфир—1-бутанол (Ladisch, Gillard, 1983). Для экстракции сильнополярных фосфатидили-нозитолфосфатов необходимы очень низкие значения pH (Schacht, 1981), при которых разрушаются ганглиозиды.
Легкую фазу липидного экстракта, полученного по методу Фолша, можно использовать в качестве антигена при твердофазном РИА без очистки или с дальнейшей очисткой. Его очистка состоит в освобождении от солей и низкомолекулярных примесей диализом или, что быстрее, адсорбцией липидов на патроне для обратнофазовой хроматографии с последующей элюцией их органическим растворителем. Освобождение экстракта от солей и низкомолекулярных примесей является обязательным этапом, если материал будет использован для ТСХ. Фиксированные формальдегидом клетки можно экстрагировать так же, как и нативные. Однако образцы тканей следует гомогенизировать перед экстракцией, поскольку после фиксации эта процедура существенно осложняется. Лучше измельчить ткань в десятикратном объеме воды в небольшом электрическом блендере и перед экстракцией гомогенат лиофилизовать.
Хотя клеточные липиды более стабильны, чем белки, они подвержены окислению кислородом воздуха, так как в их состав входят ненасыщенные жирные кислоты. Поэтому при длительном хранении их следует держать при низкой температуре в атмосфере азота.
Б. Материалы
Хлороформ (ч. д. a., analytical grade)
Метанол (ч. д. a., analytical grade) Стеклянные центрифужные пробирки на 10 мл Источник азота
11—1278
162 Глава 9
Одноразовый патрон для обратнофазовой хроматографии С18 (100 мг) (Analytichem International, Harbour City, CA, and J. T. Baker Chem. Co., Phillipsburg, NJ).
В. Процедура экстракции
Нативные клетки (108) или клетки, фиксированные 0,5^0 -ным формальдегидом, промывают забуференным фосфатами физиологическим раствором (ЗФР) и осаждают на дно стеклянной центрифужной пробирки. Осадок сначала ресуспендируют в
2 мл метанола, а затем к суспензии добавляют 2 мл хлороформа. После инкубации в течение 15 мин с периодическим встряхиванием на вортексе суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 5000 об/мин и супернатант переносят в чистую стеклянную пробирку. К нему добавляют 2 мл хлороформа, 1,2 мл воды и тщательно перемешивают смесь пипетированием пастеровской пипеткой. Суспензию разделяют на легкую и тяжелую фазы центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин при комнатной температуре. Верхнюю фазу (объем примерно 2,5 мл) можно использовать в качестве антигена для РИА без дальнейшей очистки. Если необходим более чистый препарат, то верхнюю фазу концентрируют до конечного объема 1 мл при 37 °С в водяной бане с помощью потока азота.
Патрон С18 для обратнофазовой хроматографии сначала промывают 2 мл смеси хлороформ — метанол (1:1) при небольшом давлении, создаваемом резиновой грушей или пастеровской пипеткой, а затем — последовательно 2 мл метанола и
2 мл воды. После этого через патрон медленно пропускают концентрированную верхнюю фазу и затем 2 мл воды и воздух. Липиды элюируют 1 мл смеси хлороформ — метанол (1:1) и элюат высушивают в потоке азота.
IV. ТВЕРДОФАЗНЫЙ РИА
А. Принцип метода
Липидные антигены можно определять с помощью простого качественного теста с применением твердофазного РИА или иммуноферментного анализа ELISA в 96-луночных панелях для микротитрования. По аналогии с процедурами, используемыми при анализе адсорбированных на панелях белковых антигенов, липиды также можно сорбировать на поверхности лунок из обработанных ультразвуком водных суспензий. Однако более удобно вносить липиды в лунки панелей в метаноле или этаноле (Brockhaus et al., 1981; Kannagi et al., 1983), а затем давать возможность растворителю испариться. Для этих целей
Обнаружение гликолипидных антигенов
163
можно использовать верхнюю фазу липидного экстракта, но не следует применять растворы в смеси хлороформ — метанол, так как хлороформ растворяет материал, из которого сделаны панели.
