Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 59

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 239 >> Следующая

Г. Получение липосом
с использованием полистирольных гранул SM2
Липосомы содержат не более 50 7о мембранных белков по массе. Это примерно соответствует составу мембран лимфоцитов. Для получения липосом смешивают липиды и мембранные белки в растворе детергента, а затем детергент удаляют. Поскольку удаление тритона Х-100 диализом — процесс весьма длительный, более предпочтительно его удаление с помощью сорбции на полистирольных гранулах SM2. Они представляют собой гидрофобные частицы, способные к сильной адсорбции
156 Глава 8
молекул детергента (Holloway, 1973). Смесь липидов и белков в растворе детергента инкубируют, встряхивая ее с гранулами SM2 до тех пор, пока не сформируются липосомы.
Реагенты
1. Гранулы SM2 (Bio-Rad Laboratories), промытые метанолом и затем водой
2. Буфер для реассоциации (5Х)-' 0,5 М NaCl, 0,1 М трис-НС1, pH 8,0, 0,01 М азид натрия
3. Пленка клеточных липидов (разд. III, Б) или липидно-детергентная смесь (разд. III, В)
К смеси, содержащей 1 мг липидов, 1 мг белков и 10 мг тритона Х-100 в объеме 1 мл, добавляют 0,25 мл буфера для реассоциации и 0,2 мл гранул SM2. Инкубируют смесь при постоянном встряхивании 3 ч при 20 °С, а затем удаляют жидкую фазу и добавляют к ней новую порцию (0,2 мл) гранул SM2. После еще одной инкубации со встряхиванием в течение 3 ч супернатант должен начать опалесцировать, что указывает на образование липосом.
Д. Получение липосом после удаления
детергента диализом
Если белки, выделенные на лентил-лектиновом или иммунном носителе, требуется реассоциировать с липидами после удаления детергента диализом, то необходимо заменить тритон Х-100 на детергент с малым размером мицелл, например на ок-тилглюкозид. Это легче всего сделать в тот момент, когда белки адсорбированы на аффинной колонке. Через колонку пропускают один объем буфера без тритона Х-100, содержащего 4,5мг/мл октилглюкозида.
Реагенты
1. Предварительно вымытые диализные мешочки
2. Липидно-детергентная смесь (разд. III, В)
3. Белки в буфере, содержащем октилглюкозид (4,5 мг/мл)
4. Буфер для реассоциации: 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-НС1, pH 8,0, 2 мМ азид натрия
К липидно-детергентной пленке добавляют раствор белка и тщательно перемешивают смесь при комнатной температуре. Смесь переносят в диализный мешочек и диализуют против буфера для реассоциации в течение 18 ч с тремя сменами буфера. На образование липосом указывает появление в липидно-белковой смеси опалесценции.
Е. Очистка липосом
Липосомы, полученные после удаления детергента из липидно-белкового раствора, очищают с использованием центрифугирования в градиенте сахарозы (Helenius et al., 1977). При этом
Получение липосом
L5T
из препарата липосом удаляются растворимые и денатурированные белки.
На градиент сахарозы 15—60% (объем 4 мл) в центрифуж' ной пробирке для ротора SW50 (Beckman) наслаивают 1 мл липосомной суспензии. Градиент центрифугируют в течение ночи при 50 ООО об/мин в роторе SW50 или эквивалентном ему. Положение липосом в градиенте определяют по радиоактивности, если белки были помечены, или по содержанию белка) (MeKnight, 1977). Содержание белка в липосомах может быть-косвенно оценено по их положению в градиенте, т. е. по их плавучей плотности. Связанные с липидами белки обычно обнаруживаются при концентрациях сахарозы от 15% (содержание белка менее 5%) до 35% (50% белка). Денатурированные агрегированные белки находятся на дне пробирки, а растворимые белки — в верхних фракциях градиента.
Полезно анализировать состав липосом с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Различные белки по-разному «реагируют» на условия реассоциации; одни из них накапливаются в липосомах, в то время как другие частично или полностью теряются.
IV. ПРИМЕНЕНИЕ
А. Активация цитотоксических Т-клеток
Липосомы можно использовать как активаторы цитотоксических Т-клеток. Клетки селезенки животных, иммунизированных аллогенными клетками, могут быть рестимулированы in vitro липосомами, несущими антигены гистосовместимости (Fast,. Fan, 1978; Engelhard et al., 1978). Липосомы обычно стерилизуют УФ-светом или -у-облучением. К культурам спленоцитов добавляют микрограммы реассоциированного с липидами белка; большие дозы оказывают ингибирующее действие. Клетки культивируют в течение 5 дней, а затем тестируют на цитотоксиче-скую активность, используя в качестве клеток-мишеней активированные митогенами бластные формы или линии опухолевых клеток.
Липосомы, содержащие мембранные белки, могут сливаться с клетками, что приводит к переносу их содержимого на мембраны клеток-мишеней (Hale et al., 1980). Подобным образом могут переноситься в клетки-мишени лекарственные препараты или макромолекулы, включенные в липосому (Leserman et al., 1981).
158 Глава 8
Б. Перенос макромолекул
за счет слияния липосом с клетками
Для стимуляции слияния липосом с клетками можно использовать либо белки вируса Сендай, либо полиэтиленгликоль. Белки вируса Сендай включаются в состав липосом в процессе реассоциации; при этом слияние с клетками в определенных условиях происходит спонтанно (Vainstein et al., 1983). Можно также добавлять вирус Сендай во внешнюю среду. Содержащие ¦фосфатидилэтаноламин липосомы имеют тенденцию к спонтанному слиянию с лимфоидными клетками (Correa-Freire et al., 1984).
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed